Les microtubules (MTs) sont des polymères dynamiques essentiels pour de nombreux processus cellulaires tels que la division, la migration et le transport intracellulaire. Leurs propriétés dynamiques et leur organisation spatiale sont régulées par des protéines associées, les MAPs (Microtubule-Associated Proteins). Une des premières MAPs à avoir été identifiée dans les neurones est la protéine tau, connue pour stabiliser les MTs et les organiser en faisceaux au niveau des axones. Du fait de son implication dans la maladie d'Alzheimer, tau a fait l'objet de nombreuses études et son interaction avec les MTs est aujourd'hui relativement bien caractérisée. En revanche, les mécanismes responsables de la formation des faisceaux de MTs par cette protéine restent indéterminés. Le premier objectif de ma thèse a été de définir les bases moléculaires de ce processus, grâce à la reconstitution de faisceaux de MTs in vitro et à leur observation en temps réel par microscopie à onde évanescente. Les résultats montrent que le domaine de projection de tau inhibe la formation des faisceaux, alors que les deux hexapeptides localisés dans le domaine C-terminal de tau et responsables de son agrégation au cours de la maladie d'Alzheimer sont essentiels à l'organisation des MTs en faisceaux. En parallèle, je me suis intéressée à l'effet de tau sur l'interaction MTs/actine. En effet, les filaments d'actine constituent, comme les MTs, un élément majeur du cytosquelette. La coordination entre les MTs et les filaments d'actine est essentielle à la différenciation et à l'activité neuronales. Cependant, les effecteurs responsables de cette coopération MTs/actine restent aujourd'hui très mal caractérisés. La protéine tau a été proposée comme pouvant s'associer directement à l'actine. De plus, elle a été observée dans des compartiments neuronaux riches en actine tels que l'extrémité des axones en croissance et les synapses, dans lesquels les microtubules peuvent entrer transitoirement. Tau est donc un potentiel intermédiaire moléculaire entre les MTs et les filaments d'actine. Grâce à la mise au point d'un système original permettant la visualisation de l'assemblage simultané des MTs et des filaments d'actine, j'ai étudié le rôle de tau dans la coordination des cytosquelettes de MTs et d'actine et également les mécanismes moléculaires sous-jacents. J'ai pu montrer que tau interagit simultanément avec les MTs et l'actine, induit le co-alignement des deux réseaux ainsi que leur croissance couplée. L'utilisation de formes tronquées de tau montre qu'au moins deux de ses quatre motifs répétés, initialement identifiés comme liant la tubuline, sont nécessaires à l'interaction entre les MTs et les filaments d'actine. Nous proposons un modèle selon lequel tau coordonne les deux cytosquelettes via la répartition de ses motifs répétés entre les deux types de polymères. J'ai également participé à une étude dans des neurones en culture, confirmant l'interaction directe de tau avec l'actine et la triple co-localisation tau/MTs/actine. L'ensemble de ces résultats nous ont donc permis d'identifier les bases moléculaires impliquées dans la formation des complexes macromoléculaires MTs/MTs et MTs/actine induits par tau. / Microtubules (MTs) are dynamic polymers involved in fundamental cellular processes such as cell division, migration and intracellular transport. Their dynamic properties and spatial organization are regulated by numerous Microtubule-Associated Proteins (MAPs). Tau is one of the first MAPs identified in neurons and is known to stabilize MTs and organize them into bundles in axons. Due to its involvement in Alzheimer's disease, this protein has been widely studied and its interaction with MTs is now quite well characterized. However, the mechanisms by which tau organizes MTs into bundles remain to be determined. The first aim of my thesis was to define the molecular basis of MT bundling, by using in vitro reconstitution of MT bundles and by monitoring them in real time using evanescent wave microscopy. Results show that tau's projection domain inhibits MT bundling, whereas the two hexapeptides in the tau's C-terminal domain that are involved in tau aggregation during Alzheimer's disease are fundamental for MT organization into bundles. Furthermore I focused on the effect of tau on the crosstalk between MTs and actin. Actin filaments are another major cytoskeletal elements. The coordination between MTs and actin filaments is essential for neuronal differentiation and activity. However, the effectors responsible for MTs/actin cooperation remain poorly characterized. Tau protein has been proposed to directly interact with actin filaments. Besides, tau has been observed in neuronal actin-rich compartments like the extremity of growing axons and synapses, in which MTs can enter transitorily. Thus tau appears as a potential molecular linker between MTs and actin filaments. By developing an original cell-free system to visualize concomitant MTs and actin assembly, I studied the role of tau in the coordination of MTs and actin filaments and characterized the underlying molecular mechanisms of this phenomenon. I showed that tau is able to interact simultaneously with MTs and actin filaments, inducing the co-alignment of both polymers and their coupled growth. By using truncated tau proteins, I showed that at least two of the four tau's repeat motifs, initially characterized to bind tubulin, are necessary for the MTs/actin interaction. We propose a model in which tau coordinates the two networks through the distribution of its repeat motifs between the two polymers. I also participated to a study in cultured neurons, which confirmed the direct association of tau with actin and a triple co-localization between MTs/actin and tau. Altogether, these results led us to identify the molecular basis involved in the formation of MTs/MTs and MTs/actin macromolecular complexes induced by tau.

Les microtubules sont des éléments clés du cytosquelette impliqué dans de nombreux processus cellulaires. Ce sont des structures dynamiques qui alternent continuellement entre polymérisation et dépolymérisation, un comportement appelé instabilité dynamique. Les microtubules sont particulièrement abondants dans les neurones et sont organisés sous formes de faisceaux dans les axones et les dendrites. Cette organisation particulière leur permet de maintenir la forme de ses cellules hautement spécialisées et d’assurer le transport intracellulaire d’éléments essentiels dans l’ensemble des compartiments neuronaux. De nombreux facteurs participe à la régulation de l’arrangement des microtubules dans les neurones. Parmi ces facteurs, la protéine tau fait partie de la famille des protéines associées aux microtubules (ou MAPs) et est majoritairement neuronale. Tau est un agent pontant majeur des microtubules et est également connue pour stabiliser les microtubules en stimulant leur polymérisation et en inhibant leur dépolymérisation. Malgré de nombreuses études sur l’interaction de tau avec les microtubules, les mécanismes par lesquels cette MAP contrôle leur organisation spatiale restent élusifs. Pour répondre à cette question, nous avons reconstitué in vitro des réseaux de microtubules en présence de divers isoformes, fragments et mutants de tau. La capacité de tau à induire des faisceaux stables de microtubules dépend de deux hexa-peptides localisés dans son domaine de liaison aux microtubules, et est régulée par son domaine de projection N-terminal. Nos résultats montrent que la phosphorylation spécifique de certains sites de tau inhibe soit la formation de faisceaux soit la stabilisation des microtubules, produisant des populations composées de microtubules individuels stable ou de faisceaux dynamiques. De plus, des mutations de tau impliquées dans des démences apparentées à la maladie d’Alzheimer augmentent drastiquement la capacité de tau à former des faisceaux composés de microtubules très dynamiques. Pour finir, des expériences de cryo-microscopie électroniques indiquent que tau génèrent des défauts dans la paroi des microtubules. Ces défauts sont connus pour assouplir les microtubules et pourraient donc constituer un mécanisme structural primaire permettant leur déformation au cours de la formation de faisceaux. En conclusion, nos résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme phospho-dépendant par lequel tau régule l’organisation de réseaux de microtubules. De plus, ce travail révèle comment des modifications anormales de tau, telles que des phosphorylations anormales ou des mutations, peuvent altérer l’organisation du cytosquelette dans les maladies neurodégénératives. / Microtubules are key components of the eukaryotic cytoskeleton and are involved in major cellular events. They undergo constant remodeling through alternative cycles of growth and shrinkage of their extremities, a behavior known as dynamic instability. Microtubules are particularly abundant in neurons; they are organized into bundles within axons and dendrites to maintain the polarized shape of these highly specialized cells and to allow cargo transport. Numerous factors regulate the plasticity of the microtubule network in neurons. Among them, tau is a neuro-specific microtubule-associated protein (MAP). Tau is a major microtubule bundler also known to stabilize microtubules by promoting their growth and inhibiting their shrinkage. Although the interaction of tau with microtubules has been widely studied, the mechanisms by which this protein controls the spatial organization of microtubules remain elusive. To address this question, we reconstitute in vitro microtubule self-organization in presence of various tau isoforms, fragments and mutants. We find that the ability of tau to induce stable microtubule bundles depends on two conserved hexapeptides in tau’s microtubule-binding domain and is modulated by tau’s projection domain. Furthermore, our data demonstrate that site-specific phosphorylation of tau inhibits either microtubule bundling or stabilization generating alternative networks composed of stable single or dynamic bundled microtubules. We also show that some disease-related mutations closed to the hexapeptides strikingly enhance the capacity of tau to form bundles of highly dynamic microtubules. Finally, cryo-EM experiments indicate that tau proteins induce microtubule lattice defects known to soften microtubules, a primary structural change allowing microtubule-bending deformation during bundling. Overall, our results highlight novel phospho-dependent mechanisms by which tau regulates microtubule network organization. This work also reveals how abnormal modifications of tau, such as abnormal phosphorylation or mutations found in Alzheimer’s disease and related dementia, might alter cytoskeleton organization during neurodegeneration.