Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-20T17:08:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BrunoArrivabeneCordeiro.pdf: 3457427 bytes, checksum: d1f3ce112f52ac941c0578ad24456bda (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-04T16:13:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BrunoArrivabeneCordeiro.pdf: 3457427 bytes, checksum: d1f3ce112f52ac941c0578ad24456bda (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-04T16:13:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_BrunoArrivabeneCordeiro.pdf: 3457427 bytes, checksum: d1f3ce112f52ac941c0578ad24456bda (MD5) / Os túbulos de Malpighi constituem o principal órgão excretor de insetos. Suas funções vão além da excreção, podendo participar da desintoxicação e resposta imune do inseto. A infecção por baculovírus com deleção em seu gene egt em larvas de lepidópteros promove uma degeneração precoce dos túbulos, com conseqüente melhor atividade do baculovírus, resultando em uma redução no tempo de morte das larvas. Porém, não são observados indícios de infecção nas células dos túbulos. O gene ecdysteroid udp-glucosyltransferase (egt) codifica a enzima EGT que é responsável pela transferência de unidades de UDP-galactose ou UDP-glicose para a ecdisona, inativando-a. Utilizando baculovírus AgMNPV recombinantes contendo genes marcadores egfp ou lacZ, analisou-se as alterações causadas nos túbulos de Malpighi de A. gemmatalis, utilizando microscopia de luz e eletrônicas de transmissão (MET) e varredura (MEV). Verificou-se a relação destas alterações com a ausência do gene egt e/ou presença de um gene marcador. Realizou-se um bioensaio para comparar a atividade dos baculovírus entre si. As infecções pelos baculovírus causaram alterações visíveis a partir de 24 horas pós-infecção em microscopia de luz, sendo possível observar as proteínas marcadoras presentes em células traqueolares e em regiões dos túbulos associadas às mesmas. Com o avanço da infecção, as proteínas marcadoras apresentaram-se em maiores proporções e a degeneração dos túbulos aumentou. Em MET, observou-se um aumento progressivo da desorganização das microvilosidades, alterações nos espaços citoplasmáticos, nas invaginações basais e mitocôndrias, deformações da lâmina basal, secreções apócrinas e morte celular, conforme o progresso da infecção. Por sua vez, em MEV, observou-se mudanças na superfície, a qual apresentou aspecto flácido e ressecado, reentrâncias, protuberâncias, poros e cristais conforme a progressão da infecção. No entanto, em nenhuma das análises por microscopia, observou-se indícios de infecção nas células dos túbulos de Malpighi. Os resultados mostraram uma melhor atividade dos baculovírus contendo lacZ em relação aos que contém egfp, sendo que a ausência de egt implicou em maior intensidade e velocidade das alterações. O tempo médio de morte (LT50) calculado a partir do bioensaio para os diferentes vírus revelou melhor atividade dos recombinantes contendo lacZ, sendo que o recombinante contendo egt se mostrou mais eficaz. Devido à ausência de indícios de infecção nas células dos túbulos, acredita-se que a degeneração dos mesmos é provocada indiretamente pela infecção. A morte das células dos túbulos pode estar relacionada à oncose, que pode ser provocada pela depleção das reservas energéticas, e também à apoptose, que pode ser ativada pelo acúmulo das proteínas marcadoras EGFP e LacZ. A ausência do gene egt pode estar resultando em um maior gasto energético pelo hospedeiro, agravando o processo de morte celular que está ocorrendo nos túbulos de Malpighi, resultando em redução no tempo de morte do hospedeiro. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Malpighian tubules constitute the main excretion organ of insects. Its functions go beyond excretion and may play a role in detoxification and immune defense of the insect. The infection by baculoviruses with their egt gene deleted in lepidopteron larvae promotes an early degeneration of the tubules with consequent better baculovirus activity resulting in reduction of the larvae time of death. However, there was no trace of infection in the tubules cells. The ecdysteroid udp-glucosyltransferase (egt) gene encodes the EGT enzyme, which is responsible for the transfer of UDP-galactose or UDP-glucose units to the ecdisone, inactivating it. Using AgMNPV recombinant baculoviruses containing egfp or lacZ, the alterations caused in the Malpighian tubules of A. gemmatalis were analyzed by light microscopy and transmission (TEM) and scanning (SEM) electronic microscopies. The relationship of the alterations observed with the absence of the egt gene and/or presence of a marker gene was verified. A bioassay was made to compare the baculoviruses activities among them. The infections by the baculoviruses caused visible alterations from 24 hours post-infection by light microscopy, being possible to observe the marker proteins in the tracheolar cells and regions of the tubules associated with them. As the infection advanced, the marker proteins appeared in higher proportions and the degeneration of the tubules increased. In TEM, a progressive increase was observed in the disorganization of the microvilli, alterations in cytoplasmic spaces, basal infolds and mitochondria, deformations in the basal lamina, apocrine secretions and cell death, accordingly to the progress of the infection. Meanwhile, in SEM, changes in the surface as a loose and parched aspect, reentrances, protuberances, pores and crystals, were observed according to the progression of infection. However, there was no trace of infection in the cells of the Malpighian tubules by the microscopic analyses. The results showed best activity for the baculoviruses containing lacZ compared to the ones containing egfp and the absence of egt implied in higher intensity and speed of the alterations. The mean time to death (LT50) calculated for the different baculoviruses revealed best activity of the recombinants containing lacZ but the recombinants containing egt were more pathogenic. Due to the absence of vestiges of infection in the tubules cells, it is believed that the degeneration of the tubules is provoked by infection indirectly. The cell death in the tubules might be related to oncosis, which may be activated by depletion of energy reserves and also related to apoptosis, which may be activated by accumulation of EGFP and LacZ. The absence of egt gene might be resulting in a higher energetic expense by the host, aggravating the cell death process that is taking place in the Malpighian tubules, resulting in reduction of host time of death.