Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

Background: The Wnt/β-catenin signalling pathway is activated in arrhythmogenic heart diseases such as myocardial infarction and heart failure, but it is unclear if the pathway regulates cardiac ion channels and thus may play a role in arrhythmogenesis. Previous PCR array screening from our lab showed that the transcript level of the T-type calcium channel gene Cacna1g was reduced in primary culture of neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) after activation of Wnt/β-catenin signalling with Wnt3a protein (100 ng/ml) or a small molecule activator of the pathway, CHIR (3 µM) (n=3, p<0.01). In this study, we examined the effects of Wnt/β-catenin signalling on T-type calcium channels (Caᴠ3.1), which play a key role in the pacemaker function of the sinoatrial node (SAN). Results: RT-qPCR and western blot demonstrated dose-dependent reductions in Cacna1g mRNA (n=7, p<0.01) and Cav3.1 protein (n=4, p<0.01) in NRVMs after treatment with CHIR (3 μM). There was also a decrease in Cacna1g mRNA in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) after treatment with CHIR (5 μM) (n=4; p<0.001). Patch-clamp recording demonstrated reduced T-type calcium current (ICa,T) in NRVMs after Wnt3a treatment (3 μg/ml) (n=5, p<0.05). In isolated mouse SAN tissue, perfusion with an ICa,T blocker, ML-218 (30 µM), led to dose-dependent reductions in spontaneous beating rate (n=4, p<0.0001) indicating a critical role of ICa,T in SAN pacemaking. In adult rats, activation of Wnt/β-catenin signalling through the application of CHIR in a poloxamer gel to the SAN region did not alter the in vivo heart rate in electrocardiogram (ECG) (n=8, p=0.12). However, ex vivo culture of SAN tissue from the in vivo experiments revealed a reduction intrinsic beating rate in the CHIR treated group (n=7) compared to the control (DMSO) (n=8) (p<0.05). Summary: Wnt/β-catenin signalling inhibits T-type Ca²⁺ current in cardiomyocytes by, at least partly, reduced Cacna1g mRNA and Cav3.1 protein. Activation of Wnt/β-catenin signalling reduces the intrinsic heart rate likely by inhibition of T-type Ca²⁺ current in SAN pacemaker cells.

The role of T-type calcium channels (TTCCs) in the heart is unclear. TTCCs are transiently expressed throughout the neonatal heart during a period of rapid cardiac development. A few weeks postnatally, TTCCs are no longer found in ventricular myocytes (VMs) and calcium influx via TTCCs (ICa,T) is only detected in the SA node and Purkinje system. However, pathologic cardiac stress is associated with re-expression of TTCCs in VMs. Whether ICa,T in this setting promotes cardiac growth or exacerbates cardiac function is a topic of debate. The focus of this thesis work was to examine the effect of TTCC re-expression in the normal and diseased myocardium. Our experiments were performed in a transgenic mouse model with inducible, cardiac-specific expression of α1G TTCCs. While both the α1G and α1H TTCC subtypes re-appear during cardiac disease, we specifically evaluated the effects of α1G TTCCs since mRNA levels of this TTCC subtype are markedly elevated during cardiac pathology. We found that transgenic mice with α1G overexpression had robust ICa,T with biophysical properties similar to those published in previous studies. α1G mice had a small increase in cardiac function and showed no evidence of cardiac histopathology or increased mortality. These findings were in contrast to the phenotype of transgenic mice with augmented L-type calcium channel (LTCC) activity secondary to overexpression of the β2a regulatory subunit. While the magnitude of calcium influx in α1G and β2a VMs was similar, we found that cardiac contractility of β2a mice was significantly greater than α1G mice. Also, β2a mice had significant cardiac fibrosis, myocyte death, and premature lethality compared to the benign phenotype of α1G mice. We showed that the phenotypic differences are likely related to the differential spatial localization of T- and LTCCs. Whereas α1G TTCCs were principally localized to the surface sarcolemma, LTCCs were primarily found in the transverse tubules in close proximity to the sites of sarcoplasmic reticulum calcium release. We evaluated the effect of TTCC expression during cardiac disease by inducing myocardial infarction (MI) in α1G mice. Acutely (1-week post MI), α1G mice showed similar worsening of cardiac function and mortality rates compared to control post-infarct mice. However, α1G hearts had smaller infarct sizes which correlated with increased Akt and NFAT activation in α1G than control hearts. After chronic heart failure, i.e. 7- weeks post-infarction, α1G hearts had significant hypertrophic response as determined by increased HW/BW ratio, myocyte cross-sectional area, as well as NFAT and Akt activity. Finally, α1G mice had a small survival benefit than control mice, which while statistically non-significant, suggests that TTCC re-expression does not exacerbate cardiac function as hypothesized by some investigators. We conclude that TTCCs play a minimal role in cardiac function and activate pro-survival signaling pathways in the myocardium. / Physiology

Les plantes médicinales constituent un réservoir important de substances naturelles pour la découverte de nouvelles molécules thérapeutiques. L’intérêt de ce travail est d'explorer le potentiel thérapeutique des plantes médicinales connues pour leurs vertus neuromodulatrices et potentiellement d’intérêt pour le traitement de maladies neurologiques, y compris l’épilepsie, en étudiant leur capacité à cibler l’activité des canaux calciques de type T qui jouent un rôle important dans l’hyperexcitabilité neuronale et la physiopathologie des épilepsies. Le premier objectif de ma thèse était d’étudier l’effet des extraits de plantes méditerranéennes ; Lavandula stoechas, Rosmarinus officinalis et Peganum harmala, ainsi que leurs principes actifs ; le linalol, l’acide rosmarinique et l’harmaline, respectivement, sur des courants calciques de type T en utilisant la technique patch-clamp en configuration cellule-entière. Les enregistrements électrophysiologiques à partir de cellules HEK-293 exprimant les canaux T montrent que la lavande, le romarin et l’harmal réduisent significativement les courants de type T sur la gamme de potentiel membranaire testée. Les produits naturels arrivent à déplacer l'état stable d’inactivation vers des potentiels de membrane plus négatifs et certains (Peganum harmala) accélèrent significativement la cinétique d'inactivation des canaux T. Le deuxième objectif était d’étudier l’effet anticonvulsivant et/ou antiépileptique de ces plantes et du TTA-A2 ; un bloqueur sélectif des canaux T, sur un modèle animal d’épilepsie. Nos résultats valident le PTZ et la 4-AP comme inducteurs de crises chez le poisson zèbre, ces deux modèles permettant le criblage pour des molécules anticonvulsivantes et/ou antiépileptiques. Nos résultats montrent que le romarin, la lavande ainsi que le TTA-A2 inhibent les crises pseudo-épileptiques chez ces deux modèles. Dans l’ensemble, ce projet suggère que les canaux T seraient impliqués dans les propriétés neuroprotectrices et anticonvulsivantes des plantes médicinales étudiées et valide le rôle des plantes médicinales comme source intéressante de produits thérapeutiques. / Medicinal plants represent an interesting reservoir of natural substances for the discovery of new therapeutic molecules. The interest of this work is to explore the therapeutic potential of medicinal plants, which are known for their neuromodulation effects, by studying their ability to target the activity of T-type calcium channels which play a major role in neuronal hyperexcitability and the pathophysiology of epilepsy and other neurological diseases.The first objective of my thesis was to study the effect of Mediterranean plant extracts; Lavandula stoechas, Rosmarinus officinalis and Peganum harmala and their active ingredients; linalool, rosmarinic acid and harmaline, respectively, on T-type calcium currents using the patch clamp technique in whole-cell configuration. Electrophysiological recordings from HEK-293 cells expressing T-type channels show that lavender, rosemary and Harmal significantly reduce T-type currents over the potential range tested. The natural products shifted steady-state inactivation towards more negative membrane potentials and some plants (Peganum harmala) significantly accelerate the inactivation kinetics of T-type channels. The second objective was to study the anticonvulsant / antiepileptic activity of these plants as well as TTA-A2, a selective T-type channel blocker, in an epilepsy model in zebrafish. Our results validate the PTZ and 4-AP as inducers of convulsions in zebrafish and both models could be used to screen for anticonvulsant and/or antiepileptic molecules. Our results show that rosemary, lavender and TTA-A2 inhibit seizures-like activity in these two models. Overall, this project suggests that T-type channels are involved in the neuroprotective and anticonvulsant properties of the studied medicinal plants and validates the role of medicinal plants as a valuable source of therapeutic products.

De nombreuses études expérimentales montrent que les canaux calciques activés par la dépolarisation membranaire, tout particulièrement les canaux calciques de type T (canaux T), jouent un rôle important dans la physiopathologie des épilepsies. Il existe trois isoformes des canaux T, Cav3.1, Cav3.2 et Cav3.3, toutes exprimées au niveau neuronal. De manière classique, c'est dans l'épilepsie absence où les canaux T ont été le plus étudiés. Les canaux T jouent également un rôle dans des modèles d'épilepsie partielle secondairement généralisée, comme le modèle pilocarpine qui mime l'épilepsie du lobe temporal (ELT). Jusqu'à présent ces canaux ne possédaient pas de pharmacologie spécifique, mais plusieurs molécules récemment synthétisées, en particulier le TTA-A2, apparaissent sélectives des canaux T. Le premier objectif de ma thèse était d'étudier l'implication des canaux T dans l'épileptogenèse. Pour cela nous avons traité des souris au TTA-A2 pendant la phase de latence du modèle pilocarpine (modèle ELT). Nos conditions expérimentales ne nous ont pas permis de conclure quant à une action protectrice du TTA-A2 dans ce modèle. Le deuxième objectif était d'étudier l'effet du TTA-A2 sur des modèles murins de convulsions généralisées : le modèle du Maximal Electroshock Seizure (MES) et le modèle pentylènetétrazole (PTZ). Deux lignées de souris inactivées pour les isoformes Cav3.1 ou Cav3.2 (KO Cav3.1 et KO Cav3.2) ont également été caractérisées dans cette étude. Nous montrons que le TTA-A2 réduit l'apparition des crises toniques dans le modèle MES et que les souris KO Cav3.1 sont également protégées, suggérant un rôle prépondérant des canaux Cav3.1 dans le développement des crises toniques. / Numerous experimental studies show that calcium channels activated by membrane depolarization, especially T-type calcium channels (T-channels), play an important role in the physiopathology of epilepsy. There are three T-channels isoforms, Cav3.1, Cav3.2 and Cav3.3, all expressed in neuronal level. Conventionally, T-channels were the most studied in absence epilepsy. T-channels are also involved in partial secondarily generalized epilepsy models, as the pilocarpine model that mimics temporal lobe epilepsy (TLE).Up to now, there was no specific pharmacology for this channels, but several molecules have recently been synthesized, particularly TTA-A2, appearing selective T-channels. The first goal of my thesis was to study the T-channels involvement in epileptogenesis. For this purpose we treated mice with TTA-A2 during the silent phase of the pilocarpine model (TLE model). Our experimental conditions do not allow us to conclude about a possible protective action of TTA-A2 on this model. The second goal was to study TTA-A2 effects on mice models of generalized seizures: the Maximal Electroshock model (MES) and the pentylenetetrazole model (PTZ). Two mice strains knock-out for Cav3.1 or Cav3.2 (KO Cav3.1 and KO Cav3.2) have also been characterized in this study. We show that the TTA-A2 reduces the appearance of tonic seizures in the MES model and the KO Cav3.1 mice are also protected, suggesting a preponderant role of Cav3.1 channels in the development of tonic seizures.

La douleur chronique occupe une place centrale dans les préoccupations de santé publique. En France, elle touche environ 20% de la population et a un impact négatif sur la qualité de vie des patients. Les traitements actuels sont généralement inefficaces ou associés à d’importants effets indésirables. Par conséquent, de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires. Parmi les cibles potentielles, les canaux calciques voltage-dépendants de type T, en particulier l’isoforme Cav3.2, constituent des candidats d’intérêt. Aussi, l’objectif de cette thèse est de caractériser leur implication fonctionnelle dans deux types de douleur chronique : viscérale et somatique. Concernant la douleur viscérale, nous avons développé un modèle murin d’hypersensibilité colique associée à une inflammation à bas bruit, deux caractéristiques séméiologiques proches de la symptomatologie rencontrée chez la plupart des patients souffrant du syndrome de l’intestin irritable (SII) ou de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) durant les périodes de rémission. En ce qui concerne la douleur somatique, nous avons utilisé deux modèles murins de douleur inflammatoire, l’un présentant une inflammation subaiguë et l’autre persistante. Dans ces différents modèles, une inhibition pharmacologique via l’administration d’un antagoniste des canaux Cav3.2, le TTA-A2, ou génétique grâce à des souris présentant un Knock out (KO) de Cav3.2 a induit un puissant effet antalgique, démontrant une implication fonctionnelle des canaux Cav3.2 dans le développement et le maintien de ces types de douleur. De plus, l’utilisation de souris présentant un KO conditionnel de Cav3.2, spécifiquement dans les fibres C des ganglions de la racine dorsale (DRG), ainsi que l’emploi de l’ABT-639, un agent pharmacologique bloqueur des canaux de type T à action périphérique, nous ont permis de préciser la localisation de cette implication. Ainsi, une action majoritairement spinale présynaptique des canaux Cav3.2 a été mise en évidence pour la douleur viscérale alors qu’une action plus complexe de ces canaux est mise en jeu pour la douleur somatique inflammatoire. En effet, pour cette dernière, le canal Cav3.2 présente une implication à la fois spinale et périphérique. De plus, nous avons montré un rôle des canaux Cav3.2 dans le processus inflammatoire, s’effectuant au travers d’une implication de ces derniers dans les cellules immunitaires. Enfin, dans une démarche de recherche translationnelle, nous avons évalué l’effet de l’éthosuximide (ETX), un bloqueur des canaux de type T, utilisé en clinique dans le traitement de l’épilepsie. Nous avons décrit un effet antalgique de ce dernier dans chacun des modèles étudiés ainsi qu’une action anti-inflammatoire, apportant ainsi une preuve de concept préclinique pour une évaluation d’efficacité clinique de l’ETX dans un contexte de douleurs viscérales ou somatiques inflammatoires. L’ensemble de ces résultats apporte de nouvelles connaissances concernant l’implication des canaux Cav3.2 dans la douleur chronique et permet de proposer ces canaux comme des cibles d’intérêt pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes visant à soulager les patients. / Chronic pain is a central concerns to public health. In France, it affects about 20% of the population and has a negative impact on the patients’ quality of life. Current treatments are generally ineffective or associated with strong adverse effects. Therefore, new therapeutic approaches are needed. Among the potential targets, the T-type voltage-dependent calcium channels, in particular the Cav3.2 isoform, constitute candidates of interest. Thus, the objective of this thesis is to characterize their functional implication in two types of chronic pain: visceral and somatic. We have developed a murine model of colonic hypersensitivity associated with low grade inflammation, two symptomatic features close to the symptomatology found in most patients suffering from irritable bowel syndrome (IBS) or with diseases inflammatory bowel disease (IBD) during remission periods. Concerning the somatic pain, we used two murine models of inflammatory pain, one with subacute inflammation and another with persistent inflammation. In these different models, a pharmacological inhibition with the administration of a Cav3.2 channel antagonist, TTA-A2, or a genetic approach using Cav3.2 knockout (KO) mice induced a robust analgesic effect demonstrating a functional implication of Cav3.2 channels in the development and maintenance of these types of pain. Moreover, the use of mice with a Cav3.2 conditional KO, specifically in the C-dorsal root ganglia (DRG) fibers, and the use of ABT-639, a peripherally acting pharmacological blocker of type T channels, allowed us to specify the localization of this implication. Thus, a pre-synaptic spinal action of the Cav3.2 channels has been demonstrated for visceral pain whereas a more complex action of these channels is involved for inflammatory somatic pain. Indeed, for the latter, Cav3.2 channels present a spinal and peripheral implication. In addition, we have shown the role of Cav3.2 channels in the inflammatory process, with an involvement located in the immune cells. Finally, with a translational research approach, we evaluated the effect of ethosuximide (ETX), a T-channel blocker, clinically used in the treatment of epilepsy. We have described an analgesic effect of the latter in both studied models as well as an anti-inflammatory action. These results constitute a pre-clinical proof of concept for a clinical efficacy evaluation of ETX in a context of visceral pain or somatic inflammatory diseases. Altogether these results provide new insight about the involvement of Cav3.2 channels in chronic pain and allow us to propose these channels as targets of interest for the development of new therapeutic strategies to relieve patients.