Οι ενεργοποιούμενοι από Ασβέστιο, μικρής αγωγιμότητας (SK), δίαυλοι καλίου παρουσιάζουν τασεο-ανεξάρτητη δράση, ενώ ενεργοποιούνται χημειομηχανικά από αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα Ασβεστίου (σε εύρος μM), όπως συμβαίνει για παράδειγμα κατά τη διάρκεια ενός δυναμικού ενέργειας. Οι SK δίαυλοι προκαλούν το φαινόμενο της μεθυπερπόλωσης (sAHP) το οποίο περιορίζει την συχνότητα πυροδότησης του νευρώνα κατά τη διάρκεια ενός δυναμικού ενέργειας. Η υψηλή συγγένεια δέσμευσης του Ασβεστίου στους SK διαύλους οφείλεται στην ανεξάρτητη Ασβεστίου αλληλεπίδραση της SK α-υπομονάδας με το C-τελικό τμήμα της Καλμοδουλίνης (TR2C), ιδιότητα που χαρακτηρίζει τους SK διαύλους στην μεγάλη οικογένεια των διαύλων καλίου. Το TR2C τμήμα δεσμεύεται σε μια συγκεκριμένη περιοχή της α-υπομονάδας των SK διαύλων η οποία ονομάζεται CaMBD (CalModulin Binding Domain). Η περιοχή αυτή εντοπίζεται ενδοκυτταρικά στο ελικοειδές C-τελικό τμήμα της συγκεκριμένης υπομονάδας. Σε μια προσπάθεια μελέτης της αλληλεπίδρασης της ελεύθερης Ασβεστίου Καλμοδουλίνης και της CaMBD περιοχής, εφαρμόσαμε φασματοσκοπία NMR σε ένα χαρακτηριστικό της αλληλεπίδρασης σύμπλοκο, που αποτελούνταν από το C-τελικό τμήμα της Καλμοδουλίνης (TR2C) και ένα συνθετικό πεπτίδιο 23 αμινοξέων, αντιπροσωπευτικό της CaMBD περιοχής. Οι πειραματικές συνθήκες ρυθμίστηκαν με χρήση τεχνικών φθορισμομετρίας προκειμένου να καθοριστεί το βέλτιστο περιβάλλον για την αλληλεπίδραση. Η δομή της απο-Καλμοδουλίνης, σε αλληλεπίδραση με τo CaMBD τμήμα, μελετήθηκε με χρήση υψηλής ανάλυσης φασματοσκοπίας NMR (600 & 900 MHz) μέσω 2D και 3D πολυπηρυνικών (1Η, 13C, 15N) φασμάτων. Η χαρτογράφηση της διαταραχής των χημικών μετατοπίσεων στο υπό αλληλεπίδραση TR2C τμήμα αποκαλύπτει την επιφάνεια αλληλεπίδρασης μεταξύ TR2C και CaMBD τμήματος ενώ η αναλυτική δομική μελέτη οδηγεί σε μια NMR δομή για το TR2C τμήμα στο σύμπλοκο με το CaMBD τμήμα. / Small conductance Ca2+-activated potassium (SK) channels are voltage independent, chemo-mechanically gated K+ channels, which utilize as their gating cue increases in the levels of intracellular Ca2+ such as occur during an action potential. SK channels underlie the slow afterhyperpolarization (sAHP) that limits the firing frequency during an action potential. SK channels are gated solely by intracellular Ca2+ in the submicromolar range. This high affinity for Ca2+ results from Ca2+-independent association of the SK α-subunit with calmodulin C-terminal domain (TR2C), a property unique among the large family of potassium channels. TR2C binds to a specific region of the α-subunit of SK channels called the CaM binding domain (CaMBD), located intracellular and immediately C-terminal to the inner helix. In an attempt to elucidate the interaction between apo-CaM and CaMBD we apply NMR Spectroscopy to a minimal complex consisting of the C-terminal domain of CaM and a synthetic 23-residue peptide corresponding to the CaMBD core region. Experimental conditions were fine-tuned through Fluorescence spectroscopy in order to identify the optimum conditions for this interaction. The structure of apo-CaM, complexed with the CaMBD, was studied by high analysis NMR spectroscopy (600 & 900 MHz) through 2D and 3D heteronuclear (1Η, 13C, 15N) spectra. Chemical shift variation mapped over the complexed apo-CaM with sk2 peptide reveals the interaction interface while the detailed conformational analysis results to an NMR solution structure.

Calmodulin (CaM) is a highly conserved protein able to bind Ca2+. When Ca2+ is bound the protein can bind and activate further proteins with several individual functions. CaM switches to a more open conformation when Ca2+-bound and is able to do so at a high rate. Little is known about the conformational switches between apo and Ca2+-bound states. A hypothesis suggests that protonation/deprotonation of a histidine side-chain is part of the answer and thus the dynamics of CaM would be pH dependent. This was further investigated in this thesis. Methods to carry out the project included protein expression of isotope labelled CaM-TR2C E140Q, standard protein purification and protein adapted Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. The results suggest that CaM-TR2C E140Q is likely to depend on pH and that histidine 107 (H107) may have a central role in the conformational changes observed. At lower pH it was also suggested that CaM-TR2C E140Q obtained a more open conformation with weakened intramolecular interactions and that the tertiary structure of CaM-TR2C E140Q may have been disrupted. / Calmodulin (CaM) är ett, till hög grad konserverat protein med möjlighet att binda in Ca2+. Då Ca2+ är bundet kan proteinet binda och aktivera ytterligare protein med olika enskilda funktioner. CaM byter med hög hastighet till en mer öppen konformation då Ca2+ binder. Lite vetskap finns kring hur konformationsändringarna mellan apo-form och Ca2+-bunden form går till. En hypotes föreslår att protonering/deprotonering av en histidin-sidokedja kan vara en del av svaret och att CaMs dynamik därför bör vara beroende av pH. Detta undersöktes vidare i detta examensarbete. Metoder som användes för att genomföra projektet inkluderar proteinuttryck av isotopinmärkt CaM-TR2C E140Q, standardiserad proteinrening och proteinanpassad kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Resultaten föreslår att konformationsändringarna av CaM-TR2C E140Q troligen är pH-beroende och att histidin 107 (H107) kan ha en central roll vid dessa ändringar. Vid lägre pH föreslås att CaM-TR2C E140Q antar en mer öppen konformation med försvagade intramolekylära interaktioner och att tertiärstrukturen av CaM-TR2C E140Q kan ha blivit upplöst.