A Doença de Chagas, endêmica na América Latina, é causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi e atualmente já se espalha para o restante do mundo devido à migração humana. Os dois medicamentos disponíveis para o tratamento dessa doença, o Nifurtimox, (banido do Brasil), e o Benzonidazol, são eficazes somente na etapa aguda da doença e possuem efeitos colaterais severos. Recentemente, três novas substâncias para o tratamento chegaram à fase clínica de testes contra essa doença, mas ainda é necessária a pesquisa de novas moléculas contra esse parasito. A enzima Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase (GAPDH) foi selecionada como alvo para busca de moléculas potencialmente tripanossomicidas. De forma a inibir essa enzima, a busca de moléculas baseou-se na abordagem de fragmentos moleculares para encontrar substâncias com elevada eficiência de ligante. A partir de um banco de dados comercial de 500 mil moléculas, filtros moleculares de solubilidade e da Regra dos Três foram aplicados para montar uma biblioteca focalizada de moléculas. Essa biblioteca foi submetida a estudos integrados baseados na estrutura do alvo macromolecular (docagem) e do substrato da enzima (similaridade química e eletrostática) e a inspeção visual dos fragmentos bem classificados em ambas técnicas foi realizada de modo a selecionar cinco compostos de classes químicas diversas. Essas substâncias foram submetidas a ensaios enzimáticos in vitro por meio de espectroscopia de fluorescência, sendo encontrado então um fragmento com Ki de (425 ± 53) μM e eficiência de ligante de 0,33, valor bastante promissor para abordagem baseada em fragmentos moleculares. Estudos de simulação por Dinâmica Molecular (MD) foram feitos para as cinco moléculas adquiridas, com energia de interação ligante-enzima calculada usando o método MM-GB/SA. A classificação das moléculas por essa energia foi idêntica à obtida experimentalmente. Além disso, a MD possibilitou a predição de modo de interação dos fragmentos no sítio ativo da TcGAPDH e a identificação de uma nova cavidade passível de modulação de sua atividade. Uma segunda série de fragmentos foi selecionada baseada no fragmento ativo de modo a construir uma relação estrutura-atividade (SAR) teórica por MD. A SAR sugere que a presença de um átomo nitrogênio capaz de doar ligações de hidrogênio é importante para a interação, com o resíduo de aminoácido Asp210. Este resíduo de aminoácido desponta como um possível ponto de seletividade para a enzima humana, que possui uma leucina nessa posição. Além disso, a posição na substituição do anel central também está diretamente relacionada à interação da molécula com a enzima, com uma substituição 2,3 em um anel de cinco membros a mais favorável. Este trabalho identificou pela primeira vez um fragmento molecular com alta eficiência de ligante para a enzima TcGAPDH, com o auxílio do uso conjunto de técnicas baseadas na estrutura do ligante e do alvo, para seleção de moléculas, e espectroscopia de fluorescência para identificação de atividade inibitória frente à enzima. Método de simulação por MD conseguiu reproduzir os resultados experimentais e prover informações teóricas de SAR para o composto ativo. / Chagas disease is a parasitic illness endemic in Latin America caused by the trypanosomatid parasite Trypanosoma cruzi that spreads around the world due to people migration. Nowadays, Benznidazole and Nifurtimox (banned in Brazil), are used for the treatment of this disease but causes severe side effects to patients. Recently, three new molecules have reached clínical trials phase in the development of drugs against Chagas disease but it is still necessary to develop new drugs. In this studies, the enzyme Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (GAPDH) was used as a target for the search of new antitrypanosomatid molecules. It belongs to the glycolytic pathway, the major one for parasite\'s energy generation. With the aim searching a new molecule that inhibits this enzyme, the fragment-based approach guided the search of molecules with high ligand efficiency. A focused compound library was assembled from a database of 500,000 molecules using molecular and solubility filters and the Rule of Three. The integrated use of ligand (chemical and electrostatic similarity) and target (molecular docking) based drug design was carried out to rank the molecular fragments by a consensual score. Through visual inspection of the top 500 molecules five diverse fragments were selected for the in vitro enzymatic assays using fluorescence spectroscopy. One of these molecules shows a Ki equals to (425 ± 53) μM and ligand efficiency equals to 0,33, a promising value for the fragment-based approach. Additionally, Molecular Dynamics simulations (MD) were carried out with these fragments and the predicted energy of interaction for fragment-enzyme complex was able to rank the molecules as using the experimental results. Furthermore, the MD was useful to predict the mode of interaction of the fragments in the active site of enzyme and to reveal a new cavity close to the substrate binding site. A second generation of compounds was selected based on the structure of the active fragment to construct theoretical structure-activity relationship (SAR) using MD. SAR indicates that the presence of a nitrogen with hydrogen-bond donor property is important to the interaction, making hydrogen-bonding with the amino acid residue Asp210. In addition, MD shows the influence of different substituent posítion in the central ring in the energy of the interaction, with a 2,3 substitution at five-atom ring the most favorable. This study identifies the first molecular fragment with high ligand efficiency for the enzyme TcGAPDH, with the combined use of ligand and target-based tools and fluorescence spectroscopy, for selection and identification of active compounds against the enzyme. MD was able to reproduce experimental results and generate theoretical information of SAR to the active molecular fragment.

A Doença de Chagas, endêmica na América Latina, é causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi e atualmente já se espalha para o restante do mundo devido à migração humana. Os dois medicamentos disponíveis para o tratamento dessa doença, o Nifurtimox, (banido do Brasil), e o Benzonidazol, são eficazes somente na etapa aguda da doença e possuem efeitos colaterais severos. Recentemente, três novas substâncias para o tratamento chegaram à fase clínica de testes contra essa doença, mas ainda é necessária a pesquisa de novas moléculas contra esse parasito. A enzima Gliceraldeído-3-fosfato Desidrogenase (GAPDH) foi selecionada como alvo para busca de moléculas potencialmente tripanossomicidas. De forma a inibir essa enzima, a busca de moléculas baseou-se na abordagem de fragmentos moleculares para encontrar substâncias com elevada eficiência de ligante. A partir de um banco de dados comercial de 500 mil moléculas, filtros moleculares de solubilidade e da Regra dos Três foram aplicados para montar uma biblioteca focalizada de moléculas. Essa biblioteca foi submetida a estudos integrados baseados na estrutura do alvo macromolecular (docagem) e do substrato da enzima (similaridade química e eletrostática) e a inspeção visual dos fragmentos bem classificados em ambas técnicas foi realizada de modo a selecionar cinco compostos de classes químicas diversas. Essas substâncias foram submetidas a ensaios enzimáticos in vitro por meio de espectroscopia de fluorescência, sendo encontrado então um fragmento com Ki de (425 ± 53) μM e eficiência de ligante de 0,33, valor bastante promissor para abordagem baseada em fragmentos moleculares. Estudos de simulação por Dinâmica Molecular (MD) foram feitos para as cinco moléculas adquiridas, com energia de interação ligante-enzima calculada usando o método MM-GB/SA. A classificação das moléculas por essa energia foi idêntica à obtida experimentalmente. Além disso, a MD possibilitou a predição de modo de interação dos fragmentos no sítio ativo da TcGAPDH e a identificação de uma nova cavidade passível de modulação de sua atividade. Uma segunda série de fragmentos foi selecionada baseada no fragmento ativo de modo a construir uma relação estrutura-atividade (SAR) teórica por MD. A SAR sugere que a presença de um átomo nitrogênio capaz de doar ligações de hidrogênio é importante para a interação, com o resíduo de aminoácido Asp210. Este resíduo de aminoácido desponta como um possível ponto de seletividade para a enzima humana, que possui uma leucina nessa posição. Além disso, a posição na substituição do anel central também está diretamente relacionada à interação da molécula com a enzima, com uma substituição 2,3 em um anel de cinco membros a mais favorável. Este trabalho identificou pela primeira vez um fragmento molecular com alta eficiência de ligante para a enzima TcGAPDH, com o auxílio do uso conjunto de técnicas baseadas na estrutura do ligante e do alvo, para seleção de moléculas, e espectroscopia de fluorescência para identificação de atividade inibitória frente à enzima. Método de simulação por MD conseguiu reproduzir os resultados experimentais e prover informações teóricas de SAR para o composto ativo. / Chagas disease is a parasitic illness endemic in Latin America caused by the trypanosomatid parasite Trypanosoma cruzi that spreads around the world due to people migration. Nowadays, Benznidazole and Nifurtimox (banned in Brazil), are used for the treatment of this disease but causes severe side effects to patients. Recently, three new molecules have reached clínical trials phase in the development of drugs against Chagas disease but it is still necessary to develop new drugs. In this studies, the enzyme Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (GAPDH) was used as a target for the search of new antitrypanosomatid molecules. It belongs to the glycolytic pathway, the major one for parasite\'s energy generation. With the aim searching a new molecule that inhibits this enzyme, the fragment-based approach guided the search of molecules with high ligand efficiency. A focused compound library was assembled from a database of 500,000 molecules using molecular and solubility filters and the Rule of Three. The integrated use of ligand (chemical and electrostatic similarity) and target (molecular docking) based drug design was carried out to rank the molecular fragments by a consensual score. Through visual inspection of the top 500 molecules five diverse fragments were selected for the in vitro enzymatic assays using fluorescence spectroscopy. One of these molecules shows a Ki equals to (425 ± 53) μM and ligand efficiency equals to 0,33, a promising value for the fragment-based approach. Additionally, Molecular Dynamics simulations (MD) were carried out with these fragments and the predicted energy of interaction for fragment-enzyme complex was able to rank the molecules as using the experimental results. Furthermore, the MD was useful to predict the mode of interaction of the fragments in the active site of enzyme and to reveal a new cavity close to the substrate binding site. A second generation of compounds was selected based on the structure of the active fragment to construct theoretical structure-activity relationship (SAR) using MD. SAR indicates that the presence of a nitrogen with hydrogen-bond donor property is important to the interaction, making hydrogen-bonding with the amino acid residue Asp210. In addition, MD shows the influence of different substituent posítion in the central ring in the energy of the interaction, with a 2,3 substitution at five-atom ring the most favorable. This study identifies the first molecular fragment with high ligand efficiency for the enzyme TcGAPDH, with the combined use of ligand and target-based tools and fluorescence spectroscopy, for selection and identification of active compounds against the enzyme. MD was able to reproduce experimental results and generate theoretical information of SAR to the active molecular fragment.