En aquest estudi es presenta el procés d'obtenció d'una proteïna recombinant, l'hormona gonadotrofina coriònica equina (eCG) en el llevat metilotròfic Pichia pastoris.S'ha sintetitzat els gens mitjançant la tècnica de PCR, ja que les seqüències són relativament curtes, 294 i 472 nucleòtids pels gens codificadors de la cadena α i β, respectivament. Això ha permès poder modificar la seqüència per tal d'adaptar-la a l'ús codons més utilitzats per P. pastoris, eliminar i afegir dianes de restricció per facilitar el clonatge, eliminar la seqüència senyal pròpia i treure els introns que conté la seqüència genòmica de la cadena β.D'acord amb la seqüència de DNA optimitzada obtinguda s'han dissenyat una sèrie d'oligonucleòtids amb una petita part de seqüència solapada que serviran per la síntesi de cada un dels dos gens. La tècnica de PCR ha permès la fusió d'aquests oligonucleòtids per obtenir els dos gens, els quals s'han clonat al plasmidi d'expressió pPICZα sota el control del promotor AOX.A partir dels plasmidis que contenen només un dels dos gens s'han obtingut dues construccions que contenen els dos cassets d'expressió en els dos ordres possibles: pPICZα-eCGα+β i pPICZα-eCGβ+α.S'han obtingut cinc transformants amb cada construcció, se n'ha avaluat la seva capacitat productiva amb cultius en erlenmeyer i una transferència de punts. S'han fet cultius en discontinu i en discontinu alimentat per produir suficient hormona per poder desenvolupar un procés de purificació i poder caracteritzar parcialment l'hormona recombinant. La cua de 6 histidines present en la cadena α hauria de permetre fer una purificació en un sol pas amb una cromatografia d'afinitat amb metalls quelants, però no ha estat així; la proteïna era incapaç d'unir-se a la resina i per tan, no s'ha pogut separar de la resta de proteïnes del brou mitjançant aquesta tècnica.Per això s'ha plantejat un procés de purificació més complex, tot i que s'ha procurat minimitzar-ne el nombre d'etapes. La concentració inicial del brou obtingut permet treballar amb volums més reduïts. Segueix una diafiltració que permet disminuir l'alt contingut en sals del brou de cultiu i tenir la proteïna en un tampó estàndard. D'aquesta manera també s'han eliminat les proteïnes de pes molecular més petit de 10 kDa.Segueixen dues etapes de cromatografia, la primera de bescanvi iònic i la segona ha estat de sedàs molecular. Amb aquest procés s'ha aconseguit un producte final suficientment pur, tot i que alguns dels resultats de la caracterització apunten que encara hi pot haver quedat alguna proteïna no desitjada de propietats físico-químiques molt semblants a la eCG.S'ha caracteritzat, breument, l'hormona recombinant parcialment purificada, comparant-la amb l'hormona nativa. S'ha determinat el pes molecular, el punt isoelèctric i el grau de glicosilació.Amb una preparació de eCG recombinant en solució salina s'han fet les proves d'activitat in vitro, que han donat positives i d'activitat in vivo, que han donat negatives.Així doncs, podem dir que s'ha aconseguit produir l'hormona eCG amb el llevat P. pastoris, tot i que falta perfeccionar el procés de purificació per a obtenir-la en quantitat i qualitat adequada. / In this study, the process of obtaining the recombinant protein equine Chorionic Gonadotrophin hormone (eCG) in the methylotrophic yeast Pichia pastoris is presented.The genes have been synthesized through the technique of PCR, since the sequences are relatively short, 294 and 472 nucleotides for the genes coding the alpha and beta chain, respectively. This has allowed to modify the sequence in order to adapt the sequence to the more used by P. pastoris, to eliminate and to add targets of restriction to improve the cloning, to eliminate the own signal sequence and to remove the introns that the genomic sequence contains.In accordance with the optimized sequence of DNA, we design four oligonucleotides for each chain, with a small part of overlapped sequence that will serve for the synthesis of each alpha and beta gene. The technique of PCR has allowed the fusion of these oligonucleotides. The genes have been cloned in pPICZα, a expression plasmid where the expression is under the control of the promoter AOX.From the plasmids that content only one of the genes, we construct the plasmids that content both cassettes of expression in the two possible orders: pPICZ-eCGα+β and pPICZ-eCGβ+α.Five transformants have been obtained with each construction, its productive capacity with erlenmeyer culture has been estimated.Cultures have been made in batch and in fed-batch for producing enough hormone for being able to develop a process of purification and being able to characterize partially the recombining hormone.The presents of 6 histidines tag in the alpha chain should allow to make a purification in one step by an affinity chromatography, but it has not been possible; the protein was incapable of joining to the resin and for so, it has not been able to break away from the rest of proteins of the broth.Because of that, a process of purification more complex has been brought up; even though it has been tried to minimize the number of stages. The initial concentration of the broth allows to work with more reduced volumes. A diafiltration allows to reduce the high concentrations of salts from the medium culture and to have the protein in a standard buffer. In this way also the proteins of smaller molecular weight (10 kDa) have been eliminated.Two stages of chromatography follow the concentration; the first is a ionic exchange and the second is a gel-filtration chromatography. With this process a final product pure enough has been achieved, even though some of the results of the characterization aim that some protein is not eliminated, a protein with Physico-chemical properties very similar to the eCG.The recombinant hormone partially purified is briefly characterized and it is compared with the native hormone. The molecular weight, the isoelèctric point and the degree of glycosylation have been determinate. With the same recombinant hormone the in vitro and in vivo activity has been analyzed, the first one gives us a positive result but not the second one.So, we can say that it has been achieved to produce the hormone eCG with the yeast P. pastoris, even though an improve of the process of purification in needed to obtain a recombinant product in a suitable quality.

En aquest treball s'utilitza el fong Trametes versicolor, per al tractament de lleixius negres. Aquestes aigües residuals, procedents de la industria paperera son molt tòxiques i contenen una elevada càrrega orgànica, constituint un veritable problema ambiental per aquelles empreses que les produeixenDesprés d'una introducció general sobre la producció del paper i la seva problemàtica ambiental, es continua amb la presentació dels resultats obtinguts. Aquests es presenten diferenciats en dos capítols:- Inicialment es presenten les investigacions realitzades en el tractament del lleixius negres amb el fong Trametes versicolor. Aquests treballs es varen iniciar amb erlenmeyer, determinat-se les condicons de treball en quant a temperatura agitació i concentració de glucosa. Seguidament es passà a realitzar assaigs amb bioreactors. S'han utilitzat diferents tipus de bioreactors i de diferents volums. S'ha treballat des de tancs agitats de 300 ml, fins a un reactor tipus air-lift de 2 l. Els millors resultats, però, s'han obtingut amb reactors de tipus llit fluiditzat de 450 ml i reactors de llit fix de 450 ml. S'ha treballat amb el fong en forma de pellets i amb el fong immobilitzat en cubs de niló i d'escuma de poliuretà. A partir dels resultats obtinguts s'ha estudiat tant, la relació entre la producció enzimàtica i els paràmetres ambientals seguits com, la relació entre si dels diferents paràmetres ambientals.- En un segon apartat es presenten els treballs duts a terme en el monitoratge del procés. En aquest sentit s'ha realitzat el muntatge d'un sistema d'adquisició de dades que inclou, mesura del pH i del pO2 i, mesures en línia, utilitzant la tècnica FIA (Flow Injection Analysis) del color, els compostos aromàtics i dels enzims lacasa i lignina peroxidasa. A més, en realitzar la validació del FIA de lignina peroxidasa amb lleixius negres, es va detectar un problema d'inhibició de l'enzim en presència de composts lignínics.El treball finalitza amb l'Apèndix, on s'inclouen una bona part dels programes, muntatges i circuits electrònics realitzats, que han estat utilitzats en el monitoratge del procés. / En este trabajo se utiliza el hongo Trametes versicolor, para el tratamiento de lejías negras. Estas aguas residuales, procedentes de la industria papelera son muy tóxicas y contienen una elevada carga orgánica, constituyendo un verdadero problema ambiental en aquellas empresas que las producen.Después de una introducción general sobre la producción del papel y su problemática ambiental, se continúa con la presentación de los resultados obtenidos. Estos se presentan diferenciados en dos capítulos:- Inicialmente se presentan las investigaciones realizadas en el tratamiento del lejías negras con el hongo Trametes versicolor. Estos trabajos se iniciaron a escala erlenmeyer, determinándose las condiciones de trabajo en cuanto a temperatura agitación y concentración de glucosa. Seguidamente se pasó a realizar ensayos con biorreactores. Se han utilizado diferentes tipos de biorreactores y de diferentes volúmenes. Se ha trabajado con reactores de tanque agitado de 300 ml, así como con un reactor tipo air-lift de 2 l. Los mejores resultados, pero, se han obtenido con reactores de tipo lecho fluidizado de 450 ml y reactores de lecho fijo de 450 ml. Se ha trabajado con el hongo en forma de pellets y con el hongo inmovilizado en cubos de nylon y de espuma de poliuretano. A partir de los resultados obtenidos se ha estudiado tanto, la relación entre la producción enzimática y los parámetros ambientales seguidos como, la relación entre si de los diferentes parámetros ambientales.- En un segundo apartado se presentan los trabajos llevados a cabo en la monitorización del proceso. En este sentido se ha realizado el montaje de un sistema de adquisición de datos que incluye, medida del pH y del pO2 y, medidas en línea, utilizando la técnica FÍA (Flow Injection Analysis) del color, los compuestos aromáticos y de las enzimas lacasa y lignina peroxidasa. Además, al realizar la validación del FÍA de lignina peroxidasa con lejías negras, se detectó un problema de inhibición de la enzima en presencia de compuestos lignínicos.El trabajo finaliza con un Apéndice, dónde se incluyen una buena parte de los programas, montajes y circuitos electrónicos realizados, que han sido utilizados en la monitorización del proceso. / In this work the white-rot fungus Trametes versicolor is used for the treatment of black liquors. This type of wastewaters, coming from the pulp and paper industry, are very toxic and they content a high organic load, constituting a significant environmental problem for those companies that produce them.A general introduction on the pulp and paper industry and its environmental problems is followed with the presentation of the obtained results. These results are shown in two main chapters:- Initially the research carried out with Trametes versicolor applied to the treatment of black liquor is shown. These works started at Erlenmeyer level, to determine the work conditions with respect to agitation, temperature and glucose concentration. Next, assays in bioreactor were carried out. Different types of bioreactors (with different volumes) have been used. Work was performed with agitated tanks of 300 ml, and air-lift type reactor of 2 l. The best results, however, were obtained when 450 ml bed fluidized reactor was used. Assays were performed with the fungus in the form of pellets and with the fungus immobilized in cubes of nylon and polyurethane foam. From the obtained results, correlations between the enzymatic production and the environmental parameters, and the correlation among the different environmental parameters, have been studied.- In a second chapter research carried out on process monitoring are presented. An automated system for on-line measurement of enzyme activity is proposed. The system uses a flow injection manifold in the stopped-flow mode to measure initial reaction rates. The time during which the flow is halted is selected in such a way as to optimise the enzyme/substrate ratio for the correct determination of activity values. The proposed system was used to determine the activity of laccase produced by the fungus Trametes versicolor immobilised on nylon in a fixed-bed reactor used for treating pulp mill waste water. Also a data acquisition system was developed for the monitoring of pH, pO2, color and aromatic compounds.

Esta tesis se basa en el diseño de estrategias de gestión de inventario en cadenas de suministro usando la teoría de control. El principal objetivo es proponer un esquema de control para resolver los principales problemas que aparecen en el controla gestión de inventario de una cadena de suministro (incertidumbre en el retardo, el efecto látigo y el déficit de inventario). Este objetivo principal se divide en dos objetivos: 1. La neutralización de los efectos causados por el retardo de entrega de un pedido. 2. Diseño de políticas de inventario que permitan un balance entre el rechazo a la perturbación (demanda) y el seguimiento del inventario objetivo. Dado que el esquema de control por modelo interno (IMC) permite tratar los objetivos (1) y (2) bajo el mismo paradigma de control, pero de una manera disociada, éste se presenta en esta tesis como una nueva política de reposición de inventario en cadenas de suministro. Sin embargo, el IMC requiere el conocimiento del retardo para compensar sus efectos. Esta situación no es viable cuando el retardo cambia durante el proceso, situación común en las cadenas de suministro. Por lo tanto, la investigación empieza con la identificación del retardo. Así, en esta tesis se formula un algoritmo de identificación que permite estimar el verdadero valor de los retardos de la cadena de suministro. Estos valores se utilizan para adaptar el bloque de retardos en el esquema de control. De ese modo, el objetivo (1) se finaliza. El objetivo (2) se basa en el diseño de los controladores del esquema IMC. El objetivo de los controladores de IMC es mantener los niveles de inventario de la cadena de suministro cerca del inventario objetivo mitigando el efecto látigo. Cada entidad de la cadena de suministro puede operar en varios modos de trabajo durante el tiempo: suministro infinito y suficiente existencia, (SISE), suministro infinito y Bajas existencia, (SIBE), Suministro limitado, (SL). Cuando el tiempo de espera es demasiado largo y existe incertidumbre en la demanda, muchas empresas optan por utilizar una estrategia de inventario de seguridad para garantizar la satisfacción de la demanda del cliente. En virtud de esta estrategia de la cadena de suministro está siempre en el modo de trabajo (SISE). Cuando el inventario es insuficiente, la cadena de suministro puede trabajar en cualquiera de los modos de trabajo (SISE), (SIBE) o (SL). Por lo tanto, comenzamos proponiendo el diseño del sistema de control para una cadena de suministro bajo la estrategia de inventario de seguridad (SISE). El diseño está basado en las directrices del esquema IMC en el cual se realiza un balance entre la mitigación del efecto látigo y el seguimiento del inventario. Después de eso, el sistema de control se diseña para una cadena de suministro trabajando sin inventario de seguridad (es decir, en cualquier modo de funcionamiento (SISE), (SIBE) o (SL)). Por lo tanto, se propone un sistema de control de inventario conmutado bajo la estrategia de control descentralizado. Este consiste en un banco de controladores diseñados para cada posible caso de funcionamiento de cada entidad y una lógica de conmutación que selecciona el mejor controlador en cada instante de tiempo. Así, el objetivo (2) está terminado. / This thesis relies on the design of inventory management strategies in supply chain systems by using control theory approaches. The main objective is to propose a control scheme to solve the principal problems appearing in the inventory control of the supply chain (uncertainty in the lead time, the bullwhip effect and the inventory drift). This objective is divided in two particular objectives: 1. On the one hand, the counteraction of effects caused by the existing delay between the time at which an order is placed on the immediate supplier and the moment at which the petition is satisfied. 2. On the other hand, the design of inventory policies allowing a trade-off between the disturbance (demand) rejection and the inventory target tracking. Since the internal model control scheme (IMC) allows to tackle the objectives (1) and (2) under the same paradigm of control but in a decoupled way, the IMC scheme is presented in this thesis as a novel inventory replenishment policy for the entire supply chain. Nevertheless, the IMC requires the perfect knowledge of the lead time to compensate its effects. This situation is not viable when the delay changes during the process which is a common situation in supply chains. Hence, first of all, the research is focused on the identification of the lead time. As a result of this part of the research, an identification algorithm that allows to estimate the actual delay values of the entire supply chain at each time interval is formulated. The estimated delay values are used to adapt the delay block in the control scheme. Thereby, the particular objective (1) is finalised. The objective (2) relies on the design of the IMC scheme controllers. The aim of the IMC controllers is to keep the inventory levels of the supply chain close to the inventory target mitigating the bullwhip effect. Each echelon of the supply chain may operate under several working modes during the time: Infinite Supply and High stock, (ISHS), Infinite Supply and Low Stock, (ISLS), Limited Supply, (LS). When the lead time is too long and there exist uncertainty in the demand level, many companies choose to use a safety stock strategy to assure the customer demand satisfaction. Under this strategy the supply chain is always in the (ISHS) working mode. When the stock is insufficient, the supply chain may work under any of (ISHS), (ISLS) or (LS) working modes. Therefore, we start proposing the design of the control scheme for supply chain under safety stock strategy (ISHS). The design is based on the IMC guidelines where a trade-off between the bullwhip effect avoidance and inventory tracking is carried out, which is the second objective of the research. After that, the control scheme is designed for a supply chain working without safety stock (i.e. under any working mode (ISHS), (ISLS) or (LS)). Therefore, we propose a switched inventory control system for a serial multivariable supply chain under decentralized control strategy. This consists in a bank of controllers designed for each possible operation case of each echelon and a switching logic that selects the best controller at each instant time. Thus, the objective (2) is finalised.

Pichia pastoris es identificada como una de las factorías celulares más eficientes para la producción de proteínas recombinantes. Más de 500 proteínas han sido expresadas usando este sistema de expresión. P. pastoris combina la habilidad de crecer en medios mínimos a altas densidades celulares con la de secreción de proteína heteróloga, ayudando a su recuperación. En este trabajo, la proteína modelo seleccionada es la lipasa recombinante de Rhizopus oryzae (ROL). La producción heteróloga de ROL en cultivos fed-bach de P. pastoris PAOX1 (Mut+) ha sido estudiada desde el punto de vista de la monitorización y control del bioproceso, la modelización cinética y el diseño y desarrollo de estrategias operacionales. El primer paso en la investigación ha sido la estimación de la concentración de biomasa, sustrato y velocidad específica de crecimiento (μ) mediante dos observadores no lineales y uno lineal. El objetivo de este estudio ha sido comparar las prestaciones de los diferentes algoritmos en bioproceso de P. pastoris. La producción de proteína recombinante está estrechamente relacionada con la μ. Por lo tanto, debido a su elevada relevancia en el bioproceso, μ fue estimada utilizando el análisis de los gases de salida en línea o las medidas de la concentración de sustrato. La biomasa y el sustrato fueron obtenidos directamente de sus correspondientes balances de materia. La estrategia de cultivo más frecuentemente utilizada para conseguir altas densidades celulares y elevada producción de proteína heteróloga con el sistema PAOX1 (Mut+) es la operación fed-batch. Las estrategias operacionales estándar están basadas en el control de la concentración de sustrato próximas a cero (estrategias limitantes) o manteniendo la concentración a un valor contante (estrategias no limitantes). En consecuencia se estudió el efecto de las estrategias operacionales fed-batch de metanol no limitante (MNLFB) y metanol limitante (MLFB) en la producción de ROL. Éstas son las estrategias de control más comunes que tienen como objetivo mantener contantes las velocidades específicas claves: crecimiento celular (μ), consumo de sustrato (qs) y producción de proteína (qp) a partir de la hipótesis de estado quasiestacionario para el sustrato. Los resultados se analizaron con el objetivo de determinar la condición más apropiada en función de rendimientos y productividades. Las velocidades específicas medias y las variables de estado para varios cultivos fedbatch, bajo condiciones de metanol limitante y no limitante, se usaron para el desarrollo de un modelo macrocinético no estructurado para la producción heteróloga de la ROL por el sistema P. pastoris PAOX1. Posteriormente, se ha realizado un metaanálisis comparativo sobre la producción de varias proteínas heterólogas modelo para P. pastoris bajo el promotor AOX1 y se ha desarrollado una estrategia general para mejorar la producción de proteínas a partir de la cinética como clave para la optimización del proceso. Adicionalmente se ha estudiado y caracterizado la capacidad de transferencia de oxigeno en diferentes biorreactores a escala laboratorio y piloto. El modelo de transferencia de oxigeno ha sido también desarrollado y validado en la producción de ROL en P. pastoris bajo el promotor AOX1. Finalmente, el modelo cinético previamente desarrollado para la producción heteróloga de ROL y el modelo de transferencia de oxigeno han sido aplicados para definir estrategias alternativas de operación basadas en operaciones con oxígeno limitante (OLFB) comparándose con las estrategias estándar. / Pichia pastoris is recognized as one of the most efficient cell factories for the production of recombinant proteins. More than 500 proteins have been expressed using this system. P. pastoris combines the ability of growing on minimal medium at very high cell densities with secreting the heterologous protein, aiding to their recovery. In this work, the selected target protein has been is the recombinant Rhizopus oryzae lipase (ROL). The heterologous ROL production in P. pastoris PAOX1 (Mut+) fed-batch cultures has been studied for bioprocess monitoring and control, kinetic modelling, and the design and development operational strategies. The first step in the research has been the estimation of biomass, substrate and specific growth rate (μ) by means of two non-linear observers and a linear estimator. The aim of this study has been to compare the performance of the different algorithms in P. pastoris bioprocesses. Heterologous protein production is closely related to μ. So, due to its high relevance in the bioprocess, μ has been estimated by on-line gas analyses or substrate concentration measurements. Biomass and substrate have been straightforwardly obtained solving their corresponding mass balances. The most frequently used cultivation strategy to achieve high cell densities and high heterologous protein production levels with PAOX1-(Mut+)-based system is the fedbatch operation. The standard operational strategies are based on the control of the substrate concentration close to zero (limiting strategies) or keeping the concentration at a constant value (non-limiting strategies). Consequently, the effect of methanol nonlimiting fed-batch (MNLFB) and methanol limited fed-batch (MLFB) operational strategies on ROL production has been studied. These most commonly applied control strategies allow maintaining rather constant key specific rates: cell growth (μ), substrate uptake (qs), and protein production (qp) through the quasi-steady state hypothesis for substrate. Results have been analyzed in order to determine the most suitable operating conditions in terms of yields and productivities. Furthermore, mean specific rates and state variables for various fed-batch cultures, under methanol limited and non-limited conditions were used for modeling. Hence, an unstructured macrokinetic model for heterologous ROL production by a P. pastoris PAOX1 based system has been developed. Then, a comparative meta-analysis of heterologous protein production of various target proteins by P. pastoris under AOX1 promoter has been conducted and a general strategy for improving protein production from process kinetics was developed as a key to bioprocess optimization. Additionally, the characterization of oxygen transfer capacity in different laboratory/pilot scale bioreactors has been studied. The oxygen transfer model was also developed and validated in heterologous ROL production by P. pastoris under AOX1 promoter. Finally, the previous kinetic model for heterologous ROL production and oxygen transfer model have been applied to define alternative operational strategies based on oxygen limited fed-batch operations (OLFB) and have been compared to the standard strategies.

En los clusters de altas prestaciones, los requerimientos actuales de las comunicaciones de las aplicaciones, como el patrón de tráfico, el volúmen de comunicaciones entre otras, pueden cambiar a lo largo del tiempo y son difíciles de predecir. Estas necesidades generalmente exceden o no se corresponden con los recursos disponibles realmente, lo cual conlleva a una situación de desbalanceo de los recursos, congestión en la red, reducción del throughput y un incremento considerable en los valores de latencia de los mensajes. Todo esto conlleva una degradación general del rendimiento de todo el sistema computacional. Los estudios de las aplicaciones paralelas demuestran que estas tienen un comportamiento repetitivo. Además, esta repetitividad puede detectarse y caracterizarse a través de unas fases representativas. Este trabajo propone un Algoritmo de Encaminamiento Predictivo y Distribuido (PR-DRB). Este nuevo método propone controlar la congestión de la red de manera gradual basándose en la expansión controlada de caminos, la distribución del tráfico, la repetitividad en las aplicaciones paralelas y el encaminamiento adaptativo especulativo; de manera a mantener los valores de latencia controlados. PR-DRB monitorea la latencia de los mensajes en los encaminadores y guarda las mejores soluciones adaptativas encontradas a una situación de congestión. Esto se realiza de manera a re aplicar estas mejores soluciones de manera rápida ante situaciones similares futuras. Fueron desarrollados varios experimentos que generen congestión de tráfico a fin de evaluar el rendimiento de la propuesta, y se han logrado mejoras importantes en el rendimiento global del sistema. / In high performance clusters, current parallel application communication needs, such as traffic pattern, communication volume, etc., change along time and are difficult to know in advance. Such needs often exceed or do not match available resources causing resource use imbalance, network congestion, throughput reduction and message latency increase, thus degrading the overall system performance. Studies on parallel applications show repetitive behavior that can be characterized by a set of representative phases. This work presents a Predictive and Distributed Routing Balancing (PR-DRB) technique, a new method developed to gradually control network congestion, based on paths expansion, traffic distribution, applications pattern repetitiveness and speculative adaptive routing, in order to maintain low latency values. PR-DRB monitors messages latencies on routers and saves the found solutions to congestion, to quickly respond in future similar situations. Traffic congestion experiments were conducted in order to evaluate the performance of the method, and improvements were observed.

Dada la ineficiencia de las plantas de tratamiento de aguas residuales para eliminar completamente los contaminantes orgánicos, los lodos en ellas producidos constituyen una importante fuente de agentes tóxicos. Consecuentemente, la cada vez más popular práctica de aplicar lodos in tierras de uso agrícola resulta en la diseminación de estos microcontaminantes en el ambiente. El presente trabajo describe el desarrollo de una estrategia biotecnológica para la eliminación de contaminantes emergentes en lodos de depuradora, con particular énfasis en compuestos farmacéuticos, y basado en la aplicación de un hongo de la podredumbre blanca (white-rot fungus), Trametes versicolor. Este hongo es conocido por su amplia capacidad degradativa de organocontaminantes. La primera etapa de la investigación describe la evaluación preliminar de la colonización de sistemas de lodos estériles por parte del hongo (fase sólida y suspensión o “slurry”) y la capacidad de degradación de dos drogas terapéuticas modelo (carbamazepina y naproxeno) en dichos sistemas. El desarrollo de una prueba de degradación llamada ND24, diseñada para el monitoreo del estatus metabólico de T. versicolor en procesos de biorremediación en fase sólida es también descrita. A continuación, en una segunda etapa, los tratamientos en fase sólida y bioslurry fueron empleados para la degradación de fármacos, a concentraciones preexistentes, en lodos de depuradora estériles. Esta parte del trabajo fue llevada a cabo en condiciones estériles para demostrar que la eliminación se debe al hongo y no a las comunidades microbianas presentes en los lodos. En los sistemas de fase sólida (biopilas), una eliminación importante fue observada para todos los agentes terapéuticos detectados, así como una destacable reducción en la toxicidad. Similarmente, la eliminación de fármacos y otros grupos de contaminantes emergentes fue también conseguida en los reactores en “slurry”. Sin embargo, en términos de toxicidad y eliminación, el tratamiento en fase sólida mostró un mejor rendimiento comparado con el bioslurry, razón por la cual, las biopilas fueron posteriormente empleadas para el tratamiento de lodo no estéril. La tercera etapa consistió en la aplicación de T. versicolor en biopilas no estériles para la eliminación de fármacos preexistentes en lodos. Este proceso de bioaumentación fue comparado con la acción de únicamente los microorganismos autóctonos. Mediante técnicas moleculares se pudo dar monitoreo a la colonización y supervivencia de T. versicolor en el proceso y su efecto sobre las comunidades microbianas, paralelo a la degradación de los agentes terapéuticos. En un intento por obtener mayores detalles en el mecanismo de degradación, la transformación de varias sulfonamidas, usualmente encontradas en los lodos y eliminadas por el hongo, fue estudiada en profundidad. Los resultados incluyen la identificación de productos de transformación y la participación de algunas enzimas. El uso de un reactor de lecho fluidizado con pellets de T. versicolor para la eliminación simultánea de tres sulfonamidas es también descrito. / Given the the inefficiency of sewage treatment facilities to completely remove organic pollutants, the sludge produced in wastewater treatment plants constitutes an important source of contaminants. Subsequently, the increasingly popular practice of applying sludge in agricultural lands results in the spread of these micropollutants in the environment. The present work describes the development of a biotechnological approach based on the application of a white-rot fungus, Trametes versicolor, for the elimination of emerging contaminants, in particular pharmaceuticals, from sewage sludge. This fungus is known for its wide spectrum of degradation ability towards organopollutants. The first stage in the research deals with the preliminary assessment of fungal colonization of sterile sludge systems (solid-phase and slurry) and the capacity of degradation of two model pharmaceuticals (carbamazepine and naproxen) in those systems. The development of a degradation test called ND24, designed to monitor the metabolic status of T. versicolor in solid-phase bioremediation process is also described. Afterwards, in a second stage, the solid-phase and the biosurry treatments were employed for the degradation of pharmaceuticals at pre-existent concentrations from sterile sewage sludge. Work was undergone in sterile conditions in order to demonstrate that removal was due to the fungus and not to the microbial communities present in the sludge. In the solid-phase biopiles an important removal was observed for all the drugs detected, together with a remarkable reduction in the global toxicity. Similarly, elimination of pharmaceuticals and other groups of emerging pollutants was achieved in the slurry bioreactor. However, in terms of toxicological and removal values, the solid-phase biopiles showed an enhanced performance compared to the slurry, reason why the current were further employed for the treatment of non-sterile sludge. The third stage consisted in the application of T. versicolor in non-sterile biopiles for the elimination of pre-existent pharmaceuticals from sludge. This bioaugmentation process was compared with the action of solely the autochthonous microbiota. Molecular techniques permitted to monitor the colonization and survival of T. versicolor in the process and its effect over the microbial communities, parallel to the removal of the therapeutic drugs. In an attempt to obtain further insights in the mechanism of degradation, the transformation of several sulfonamides, usually found in the sludge and removed by the fungus, was studied in detail. Results include the identification of transformation products and the participation of some enzymes. The use of a continuous fluidized bed reactor with fungal pellets for the simultaneous removal of three sulfonamides is also described.

El trabajo se ha desarrollado en el marco del proyecto MELISSA (Micro Ecological LIfe Support System Alternative) de la Agencia Europea del Espacio. Este proyecto se basa en el diseño de un Sistema de Soporte de Vida basado en microorganismos que pretende gestionar la atmósfera a partir de la transformación de los residuos generados en alimento comestible. Uno de las partes del proyecto es un biorreactor de nitrificación biológica, dicha parte es la que se desarrolla en el presente trabajo. Se ha realizado la caracterización de la operación del proceso de nitrificación biológica en forma de biopelícula en reactores de lecho fijo, para lo cual se han utilizado un reactor a escala piloto (de aproximadamente 8 L de volumen total), y tres reactores a escala laboratorio (de 0.65 mL de volumen total) con las bacterias Nitrosomonas europaea (ATCC 19718) y Nitrobacter winogradskyi (ATCC 25391) inmovilizadas sobre cuentas de poliestireno (Biostyr®). Dentro de la parte de desarrollo de los reactores, se implementó la instrumentación básica y se configuró el control de las principales variables biotecnológicas que afectan al proceso de nitrificación biológica en biopelícula: pH, temperatura, oxígeno disuelto, presión, control de nivel, etc. Para profundizar en el conocimiento de este tipo de reactores se realizó una caracterización física en la que principalmente se estudió la mezcla de la fase líquida y la determinación del coeficiente de transferencia de oxígeno de la fase gas a la líquida. Posteriormente se definió y validó un modelo que permite describir la mezcla de la fase líquida en los reactores de lecho fijo que se utilizaron.Con ambos tipos de biorreactores se realizaron experimentos en continuo de nitrificación biológica para determinar el efecto de las principales variables que afectan al proceso: carga amoniacal, temperatura y oxígeno disuelto. A partir del análisis de éstos experimentos se ha definido y validado un modelo dinámico que permite describir satisfactoriamente los resultados experimentales obtenidos e interpretar diferentes aspectos con relación a la nitrificación biológica, como son la respuesta del sistema ante perturbaciones de carga amoniacal ya sea debido a variaciones en el tiempo de residencia hidráulico o variaciones de la concentración de amonio en el alimento. / The present work has been developed in the frame of the MELISSA project (Micro Ecological LIfe Support System Alternative) of the European Space Agency (ESA). The aim of the project is the design of a Life Support System based in microorganisms, to manage the atmosphere from the transformation of the generated wastes into edible matter. A part of the project is a biological nitrifying bioreactor, which is developed in the present work. A complete characterisation of the operation of the biofilm nitrification process in fixed bed reactors has been carried out. To this purpose, a pilot reactor (8 L of total volume) and three bench reactors (0.65 L of total volume) with immobilised biomass (Nitrosomonas europaea, ATCC 19718 and Nitrobacter winogradskyi, ATCC 25391) onto the surface of polystyrene beads (Biostyr®, used as physical support of the bacteria) were used.In the part of reactor development, the basic instrumentation and control configuration of the main biotechnological variables that have direct influence in the biofilm nitrification process were implemented: pH, temperature, dissolved oxygen, pressure, level control, etc. To go deeply into the study of the behaviour of these reactors, a physical characterisation was carried out. Mainly, the liquid phase mixing and the oxygen mass transfer coefficient from the gas to the liquid phase were studied. After this, a mathematical model was defined and validated in order to describe the liquid phase mixing in the fixed bed reactors used.Biological nitrifying experiments operating in continuous mode were carried out using both, pilot and bench reactors, to determine the effect of the main variables that have strong influence on the process: ammonium input load, temperature and dissolved oxygen. From the analysis of the experiments, a dynamic model that allow the proper description and interpretation of the experimental results obtained has been defined and validated. This model provides a suitable description of the system response against perturbations in the ammonium load, due to changes in the residence time used or, on the other hand, after variations in the input ammonium concentration.

Aquest treball està centrat en l’estudi de la producció de proteïnes recombinants en cultius semi-­‐continus d’alta densitat cel·∙lular utilitzant E.coli. Particularment, l’objectiu és el desenvolupament d’un model que sigui capaç de predir l’evolució amb el temps de la producció de l’Aldolasa Ramnulosa-­‐1-­‐Fosfat (RhuA). Primer, s’ha dut a terme un estudi a nivell qualitatiu i quantitatiu de les variables que juguen un paper fonamental en la producció de proteïna. Aquest estudi ha permès l’avaluació de l’impacte en la producció de proteïna (tant en unitats de massa com activitat) de les principals variables experimentals (la concentració d’inductor i biomassa en el moment d’inducció i la velocitat específica de creixement). La Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) permet la determinació de les condicions òptimes de cultiu per tal de maximitzar la producció, a la vegada que permet la determinació de les condicions de treball més adequades. Segon, s’ha desenvolupat, calibrat i validat un model de transport d’IPTG des del medi de cultiu a l’interior cel·∙lular. Aquest model aportarà un estudi més profund del sistema d’inducció. Està dividit en dues etapes: a) amb la utilització d’una soca deficient en lactosa permeases (les proteïnes responsables del transport específic de lactosa -­‐i IPTG) s’han pogut determinar els mecanismes de transport no específics; b) la contribució al transport de les proteïnes específiques s’ha afegit als mecanismes no específics. S’ha demostrat que el model és capaç de predir, no només l’evolució de la concentració d’inductor per a la soca model, sinó que ho és també per a tres soques diferents. Tercer, s’ha presentat un model acoblat (partint de tres diferents models: creixement cel·∙lular, transport d’IPTG i producció de proteïna). El model de producció de proteïna usa com a variables d’entrada les evolucions temporals de les variables dels altres dos models. La velocitat de producció de proteïna es pot relacionar amb la quantitat d’inductor unit al repressor. L’equilibri d’unió depèn de la concentració intracel·∙lular d’inductor, que és calculada mitjançant el model de transport d’IPTG. Per altra banda, el model de creixement cel·∙lular és capaç de predir l’evolució amb el temps de la concentració de biomassa i de volum total en el bioreactor, des del principi de l’etapa discontinua. Per últim, el model de producció de proteïna, juntament amb el de transport d’inductor, es pot estendre a la producció d’altres proteïnes recombinants (Fructosa-­‐6-­‐ Fosfat Aldolasa i ω-­‐Transaminasa, usant diferents sistemes d’expressió. Per a fer-­‐ho, és necessari identificar els paràmetres que son dependents del sistema d’expressió i estimar-­‐ne els valors. S’ha comprovat que el model és capaç de predir, acceptablement, l’evolució amb el temps de la producció de les noves proteïnes. En resum, aquest treball aporta un nou model que contribueix a la predicció de la producció de proteïnes recombinants usant diferents sistemes d’expressió en E.coli. / The present work is focused on the study of recombinant protein production in high-­‐ cell density fed-­‐batch cultures of E.coli. In particular, the development of a model capable to predict Rhamnulose-­‐1-­‐Phosphate Aldolase (RhuA) production is the objective. Firstly, a qualitative and quantitative study about the variables involved in protein production has been made. This study has permitted the evaluation of the impact of the main experimental variables (inducer and biomass concentration at induction and the specific growth rate) on protein production (in mass and activity units). Using a Response Surface Methodology (RSM), that is a statistical methodology, it can be determined the optimal experimental conditions that conduce to a maximum in protein production, and set the operating working conditions. Secondly, because a deeper study about the importance of IPTG in inducible E.coli systems is needed, a model describing inducer uptake has been developed, calibrated and validated. IPTG uptake model has been developed in two steps: a) using a lacY deficient strain, non-­‐specific transport mechanisms have been modeled; b) in addition to non-­‐specific transport mechanisms, lactose permeases (specific transporting proteins for lactose –and IPTG) contribution has been added. It has been demonstrated that the model is capable to predict IPTG depletion from culture medium, not only for the model strain, but also for three different strains. Thirdly, a coupled model, composed by three different ones (biomass growth, IPTG uptake and protein production) has been proposed. In this case, a new protein production model has been presented, using as inputs the time evolution of the variables involved in the other two models. Protein production rate (expressed in mass) can be related to the amount of inducer bound to the repressor. The binding equilibrium depends on the intracellular concentration of IPTG along time, which is an output of the IPTG uptake model. Otherwise, biomass growth model is able to predict biomass concentration and the total volume into the bioreactor from the beginning of the batch phase. Finally, the protein production model, coupled with the IPTG uptake model, has been extended to the production of different proteins (Fructose-­‐6-­‐Phosphate Aldolase and ω-­‐Transaminase) using different expression systems. In this case, the expression system’s dependent parameters have been identified, and the model has demonstrated that, estimating those parameters is also capable to predict, properly, the protein production along time. To sum up, this work presents a new model, which contributes to the prediction of protein production in different inducible E.coli expression systems.

En aquesta tesi es proposa un nou dispositiu que combina antenes òptiques i micro/nanoestructures mecàniques amb l'objectiu de transformar energia electromagnètica en energia mecànica. El principal objectiu de la feina realitzada és l'estudi dels mecanismes de transducció implicats. El principi de funcionament d'aquest nou dispositiu es pot resumir de la manera següent: les antenes absorbeixen la radiació electromagnètica en l'espectre infraroig i la transformen en una distribució de temperatura en l'estructura mecànica, a causa de les propietats tèrmiques del material estructural la resposta tèrmica es converteix en una deflexió mecànica que eventualment pot conduir a l'autooscil·lació del dispositiu. Donades les transformacions d'energia involucrades, el modelatge de les físiques acoblades esdevé un pas fonamental per tal de dissenyar, fabricar i caracteritzar un dispositiu de prova de concepte. La conversió d'energies es demostra que és més eficient quan el dispositiu autooscil·la. No obstant això, a causa de la naturalesa altament no lineal d'aquest fenomen, saber exactament si aquesta oscil·lació es pot aconseguir utilitzant el dispositiu de prova de concepte implica caracteritzar-lo físicament per tal d'aplicar el model desenvolupat. / In this thesis, a new device merging optical antennas and micro/nano-mechanical structures is proposed with the aim to transform electromagnetic energy into mechanical energy. The study of the involved transduction mechanisms is the main objective of the presented work. The working principle of this new device can be summarized as follows: the antennas acting as absorbers in the infrared spectrum capture the electromagnetic radiation and transform it into a temperature field in the mechanical structure. Due to the thermal properties of the structural material the thermal response is converted to a mechanical deflection which eventually can lead to the self-oscillation of the device. Given the involved energy transformations, the modeling of the coupled physics becomes a fundamental step in the path of designing, fabricating and characterizing a proof-of-concept device. The energy conversion is shown to be more efficient when the device auto-oscillates. However, due the the highly nonlinear nature of such phenomenon precisely knowing if such oscillation can be achieved using the proof-of-concept device imply its physical characterization in order to apply the developed model.

El p-Nitrophenol (PNP) es un compuesto que tiene numerosas aplicaciones en la industria química; es empleado como materia prima en la industria farmacéutica, de pesticidas y en la manufactura de cuero. Sin embargo, es un compuesto dañino para los humanos, los animales y el medio ambiente. Exposiciones repetidas al PNP pueden causar daños en los glóbulos rojos, en el sistema nervioso central y efectos mutagénicos. La selección del tratamiento adecuado para la remediación de aguas residuales industriales que contengan compuestos recalcitrantes, como el PNP, depende de la naturaleza del compuesto, su concentración y su carga. Por consiguiente, en esta tesis se realizó un estudio comparativo de diferentes tecnologías para el tratamiento de aguas residuales que contienen altas concentraciones de PNP tomando en cuenta las características de dichas aguas. Primeramente, se estudió el tratamiento biológico de aguas contaminadas con PNP en un reactor aeróbico secuencial por lotes (SBR). La puesta en marcha del reactor fue realizada utilizando como inóculo biomasa no aclimatada, proveniente de una estación depuradora de aguas urbanas, y agua sintética que contenía una mezcla de PNP y glucosa – sacarosa como fuentes de carbono. Se aplicó una estrategia operacional específica con el objetivo de desarrollar lodos activos del tipo estrategas de la K. Durante todo el período de operación se obtuvo un 100% de eliminación del PNP. Se realizaron estudios respirométricos para caracterizar cinéticamente los degradadores de PNP. Los valores cinéticos obtenidos confirmaron que la biomasa obtenida es del tipo estrategas de la K, demostrando consecuentemente el éxito de la estrategia de operación. En segundo lugar, se empleó como tratamiento la bioaumentación utilizando una población microbiana aclimatada a consumir PNP en un reactor que recibió choques de carga de PNP transitorios o continuos. Se estudió el efecto de la cantidad de población microbiana añadida empleando dos dosis diferentes obteniéndose la eliminación total del PNP durante el choque. Se demostró que la dosis de lodos especializados es el factor clave para una estrategia de bioaumentación exitosa. Este hecho, fue confirmado monitorizando la población microbiana durante los experimentos mediante la hibridación fluorescente in-situ . Asimismo, la puesta en marcha del reactor bioaumentado fue más rápida y estable en comparación con el reactor no bioaumentado. Finalmente, en el caso de aguas residuales altamente concentradas en PNP que no pueden ser degradadas en un reactor biológico, se realizó la oxidación húmeda (WAO) y la oxidación húmeda catalítica (CWAO) con el objetivo de incrementar la biodegradabilidad de los efluentes. Se estudió la influencia de la temperatura, presión parcial de oxígeno, tipo de catalizador, pH y fuerza iónica. Se realizaron diversos experimentos con cuatro catalizadores basados en Pt y Ru. La mejora en la biodegradabilidad de los efluentes fue analizada mediante ensayos respirométricos. Los resultados muestran que la eliminación de PNP fue mayor a 90% en la mayoría de los casos, siendo la temperatura el factor más importante. Más aún, la biodegradabilidad de los efluentes mejoró en más de 50% en la mayoría de los casos y se incrementaba a medida que la fracción de ácidos carboxílicos en el efluente era mayor. Así pues, se determinó que la integración de CWAO con un tratamiento biológico permitiría la eliminación del PNP y de los intermediarios que se forman durante la primera etapa del tratamiento. En conclusión, esta investigación contribuye a una comprensión más profunda de la dinámica de degradación del PNP bajo diferentes tecnologías y provee de una herramienta para la selección de la mejor tecnología de tratamiento disponible. / p-Nitrophenol (PNP) is a compound with numerous applications in the chemical industry. PNP is mainly used in the manufacturing industry of pharmaceutical products, pesticides and leather-related products. PNP is highly toxic for humans, animals and the environment. Repeated exposure to PNP may cause injury to blood cells, damage to the central nervous system and mutagenic effects. Selecting the appropriate process to treat wastewaters containing recalcitrant compounds, such as PNP, is greatly dependent on the nature of the compound itself, its concentration and its loading rate. In this thesis, a comparative study on the treatment of high-strength wastewaters containing PNP is intended by taking different approaches according to the wastewater characteristics. Firstly, biological treatment in an aerobic Sequencing Batch Reactor (SBR) was studied. The start up of the reactor was performed using a non-acclimated biomass, coming from a municipal wastewater treatment plant as inoculum and a synthetic wastewater containing a mixture of PNP and glucose-sucrose as carbon source. A specific operational strategy was applied with the aim of developing a K-strategist PNP-degrading activated sludge. Total PNP removal was achieved in the whole operating period. Kinetic characterization of the PNP-degrading population was carried out using respirometry assays. The kinetic values obtained confirmed that the biomass was of K-strategist type, thus demonstrating the success of the operational strategy. The Ki value obtained in this work was higher than others reported in the literature, meaning that the sludge was more adapted to PNP inhibition. Afterwards, bioaugmentation with an enriched microbial population was applied as treatment for facing transient or continuous shock loads of PNP. The effect of the amount of enriched microbial population added for bioaugmentation was assessed using two different dosages. In the cases tested, total PNP removal was achieved during the transient PNP shock load. However, after a long PNP starvation period, total PNP removal during a second PNP shock load was achieved, when higher doses were applied. Therefore, the dosage of specialized bacteria was established as the key factor for a successful bioaugmentation strategy. This was confirmed with the microbial characterization through fluorescence in-situ hibridisation during experiments. In addition, the performance of a bioaugmented SBR receiving a continuous PNP shock load was enhanced when compared to a non-bioaugmented SBR. Finally, in the case of highly concentrated PNP wastewaters that cannot be degraded in a biological reactor, wet air oxidation (WAO) and catalytic WAO (CWAO) were performed with the aim of increasing the biodegradability prior to a biological remediation. The influence of temperature, oxygen partial pressure, pH, ionic strength and type of catalyst on PNP CWAO was studied. Four Pt and Ru-based catalysts have been tested in batch experiments. PNP elimination, total organic carbon abatement and intermediates distribution were monitored. Respirometric tests were done to assess the biodegradability enhancement of the CWAO effluents. PNP elimination was higher than 90% in most cases. Temperature was the most important operating parameter upon CWAO. Moreover, CWAO increased biodegradability by more than 50% for most of the conditions tested; the best biodegradability enhancement was observed when the carboxylic acids fraction was the highest. An integrated CWAO and biological treatment would allow an easy removal of highly concentrated PNP and the intermediates formed during CWAO step. In conclusion, this research contributed to a deeper understanding of the dynamics of PNP degradation under different technologies and provides an aid to propose a best available technology for the removal of recalcitrant compounds from industrial wastewaters.