Orientadores: Maria Isabel Nogueira Cano, Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:46:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lira_CristinaBragadeBrito_D.pdf: 9068778 bytes, checksum: 7561201fa37b1109dc7803fb6173aad0 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A leishmaniose é uma doença parasitária que foi considerada pela Organização Mundial de Saúde como uma doença de Categoria 1, pois para a mesma não existem formas de controle, diagnóstico ou terapia eficientes. Os parasitas do gênero Leishmania (família Trypanosomatidae) são agentes etiológicos da leishmaniose e possuem cromossomos lineares com extremidades teloméricas. Os telômeros são complexos nucleoproteicos essenciais para manuntenção da estabilidade do genoma e viabilidade celular. Devido à importância das proteínas teloméricas na manutenção dessas estruturas, elas têm sido considerados bons alvos para a terapia anticâncer e antiparasitária. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi identificar proteínas que se associam aos telômeros de Leishmania amazonensis. Três metodologias diferentes foram utilizadas para antigir este objetivo: (i) purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos de L. amazonensis, (ii) busca no banco de dados de Leishmania por proteínas homólogas que apresentassem domínios de ligação ao DNA do tipo Myb, e (iii) seleção genética em levedura (sistema mono-híbrido). A purificação de proteínas teloméricas a partir de extratos nucleares de L. amazonensis resultou no isolamento da proteína LaRbp38. Ensaios in vitro de interação proteína-DNA e ensaios in vivo (imunoprecipitação de cromatina) comprovaram a interação de LaRbp38 com DNA telomérico, DNA rico em GT e DNA do cinetoplasto. LaRbp38 pode ser considerada um bom alvo para a terapia antiparasitária pois é uma proteína exclusiva de tripanosomatídeos e seu homólogo em T. brucei é essencial para a sobrevivência do parasita. Para dar início a experimentos de caracterização da estrutura dessa proteína, LaRbp38 foi expressa em bactérias. Como a proteína permaneceu na fração insolúvel, experimentos preliminares de renovelamento foram feitos mostrando que a proteína necessita da presença de DNA, ou de moléculas análogas, para se renovelar in vitro. As buscas no banco de dados de L. major resultaram no descobrimento de uma lista de proteínas que apresentam domínio de ligação ao DNA do tipo Myb. Uma proteína foi escolhida e sua homóloga em L. amazonensis foi denominada LaTBP1. O domínio Myb de LaTBP1 se localiza na porção central da proteína e apresenta alta similaridade de seqüência com domínios Myb encontrados em fatores de transcrição to tipo TFIIIB, proto-oncogene c-MYB e membros da família de proteínas teloméricas Rap1p. Ensaios de interação proteína-DNA e de imunoprecipitação de cromatina confirmaram que LaTBP1 interage tanto com o DNA telomérico quanto com DNAs ricos em GT. Prefências por estes dois tipos de DNAs são apresentadas pelas proteínas teloméricas Rap1, Taz1 e TEBP1, descritas em leveduras e eucariotos superiores. A utilização do sistema mono-híbrido para identificação de proteínas teloméricas de Leishmania resultou em uma lista de proteínas candidatas. A possível função telomérica das mesmas foi inferida com base na homologia de seqüência com proteínas já descritas e em testes de interação proteína-DNA in vitro utilizando-se extratos das leveduras recombinantes. Apesar desses resultados serem promissores, análises mais detalhadas são necessárias para confirmar estas interações. Concluindo, as três metodologias se mostraram eficazes para a identificação de proteínas teloméricas e a utilização das mesmas resultou na identificação de diversas proteínas teloméricas, algumas delas ainda hipotéticas / Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease that was classified by World Health Organization as a Category 1 disease because there are no effective control programs or therapeutics to this disease. Parasites from the Leishmania genus are the ethiologic agents of leishmaniasis and they possess linear chromosomes with telomeric ends. Telomeres are nucleoprotein specialized nucleoprotein complexes essential for maintaining chromosomal stability and cell viability. Since telomeric proteins are essential for the maintenance of telomeres, they could be considered good targets for anticancer and antiparasitic drugs. Therefore, the goal of this work was to identify Leishmania amazonensis proteins that interact with the telomeric DNA. Three methodologies were used the achive this goal: (i) purification of telomeric proteins from nuclear extracts of L. amazonensis, (ii) Leishmania genome database mining for protein containing a Myb-like domain, and (iii) use of One-hybrid system (Clontech). The search for telomeric proteins in nuclear extracts of L. amazonensis resulted in the identification of LaRbp38. EMSA and immunoprecipitation assays were used to attest LaRbp38 binding to telomeric, GT-rich and kinetoplast DNAs, both in vitro and in vivo. LaRbp38 could be considered a good drug target for antiparasitic therapy since it is exclusive of trypanosomatids and itshomologue in T. brucei is essential for parasite survival. In order to characterize structurally this protein, LaRbp38 was expressed in bacteria. The protein was present in the insoluble fraction of the bacterial lysate. Therefore, preliminary experiments of refolding were done. LaRbp38 seems to need DNA, or analog molecules, in order to correctly refold in vitro. Data-mining in the L. major genome resulted on a list of proteins bearing a Myb-like domain. One protein was chosen and its L. amazonensis homologue was termed LaTBP1. LaTBP1 Myb-like domain is centrally localized and shares sequence similarities with Myb-like domains found on transcription factors TFIIIB and c-MYB, and with the RAP1 telomeric proteins. Competition and chromatin immunoprecipitation assays confirmed the specificity of LaTBP1 for telomeric and GT-rich DNAs. This binding specifities are also found on the telomeric proteins Rap1, Taz1 and TEBP1, described in yeast and higher eukaryotes. A list of proteins with a putative telomeric function was generated after the use of the Onehybrid system. Sequence analysis (search for homologues in other organisms) and EMSA, done with protein extract of recombinant yeast, were used to infer a telomeric function for the proteins found by this methodology. Although the results are encouraging, detailed analysis are necessary to validate the interactions. In conclusion, the three methodologies were usefull for the identification of telomeric proteins. This work resulted in the identification of several telomeric candidate proteins / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular