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Producción y purificación de vectores adenovirales y adenoasociados para terapia génica contra el alcoholismo

Lucero Baeza, Alicia Trinidad January 2016 (has links)
Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Los vectores virales son un sistema de transferencia génica muy efectivo. Es por esto su amplio uso para terapia génica. Dentro del desarrollo de una terapia génica un punto muy importante a considerar es la producción y purificación de los vectores virales que transportarán dicha terapia. Su producción y purificación debe ser escalable para lograr su uso en las distintas fases de los ensayos clínicos y su posterior comercialización. El presente estudio aborda distintas etapas de la producción y purificación de vectores virales adenovirus y adenoasociados, centrándose en su uso para una terapia génica contra el alcoholismo. Se realizó la purificación de los vectores adenovirales rAd5V que contenían la secuencia de ARN antisentido de la enzima ALDH2, y se desarrolló un pre-diseño de la purificación como base para la producción de estos vectores a mayor escala para ensayos pre-clínicos. Se pudo concluir que la columna CIM QA1 tiene rendimientos tan buenos como la columna Q-Sepharose, la que ha sido muy usada para esta aplicación. Sin embargo, la columna CIM QA1 puede usar flujos hasta 10 veces mayores que la columna Q-Sepharose XL, manteniendo su rendimiento. Esto implica en una reducción del tiempo de la purificación en forma considerable. Además, se desarrolló la producción y purificación de un vector alternativo para la terapia contra el alcoholismo, el vector usado fue el vector viral Adenoasociado AAV para sus serotipos 2 y 8. Se realizó la producción de los vectores AAV2 y AAV8 y su purificación se realizó usando la columna monolítica CIM QA-1.Se pudo determinar la capacidad de la columna para cada uno de los serotipos de AAV, con una capacidad de 5,2x108 vg/ml para AAV2 y 1,8x1010vg/ml para AAV8. También se desarrolló un método simplificado para la producción de vectores AAV. El nuevo método simplificado utiliza una doble transfección en una línea celular recombinante de HEK293F, la que puede ser específica para cada terapia génica. Para este estudio, se desarrolló un prototipo del nuevo método utilizando el gen de la proteína GFP como gen de interés. Se logró desarrollar una línea celular HEK293F recombinante. Se logró producir vectores AAV2 y AAV8 con el nuevo método de doble transfección. Sin embargo, la producción fue 40 y 24 veces menor para AAV2 y AAV8 que el método convencional. A pesar que la visualización con TEM no entregó señales claras de problemas en la cápside, los vectores producidos con el nuevo método no fueron infectivos. Esto puede ser por una mala encapsidación de los vectores virales en el momento de la producción. Además, es necesario optimizar el método de producción con la proporción correcta de los tres elementos esenciales para la producción de AAV (ITR-Gen, Rep/Cap y genes ayudantes).
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Vectores virales AAV para terapia génica contra el alcoholismo: Inhibición de la enzima aldehído deshidrogenasa mitocondrial en células de hepatoma humanas

Sánchez Daza, Anamaría Constanza January 2017 (has links)
Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / El alcoholismo es un grave problema socio-económico. El costo asociado al abuso del alcohol se ha estimado en 1.300 millones de dólares para la economía chilena y en 185 billones para Estados Unidos, costo que se debe principalmente a la perdida de la productividad, tratamientos médicos y costos sociales. El etanol es metabolizado en el hígado en dos pasos. El primero depende de la enzima Alcohol deshidrogenasa (ADH) y el segundo de la enzima Aldehído deshidrogenasa (ALDH2). En individuos de la población asiática existe una alta prevalencia de una mutación en el gen de la ALDH2, por lo que tienen una capacidad reducida para metabolizar el acetaldehído, produciendo fuertes efectos como mareos, hipotensión, palpitaciones, etc. Esto resulta en un rechazo al consumo de etanol y protección frente al alcoholismo. Este fenómeno sugiere que la modulación de la expresión de la ALDH2 mediante tecnologías genéticas puede resultar en un fenotipo similar. Por lo tanto, la terapia génica se presenta como una alternativa atractiva para el tratamiento del alcoholismo, simulando el fenotipo asiático, mediante la inhibición específica de la enzima ALDH2, utilizando vectores virales codificantes de un shRNA como herramienta silenciadora. Los virus adeno-asociados (AAV) han sido utilizados como poderosas herramientas para la transferencia de genes en estudios in vivo, en modelos animales y en ensayos clínicos en humanos, con resultados prometedores. La única terapia génica aprobada en el mundo occidental para comercialización es Glybera y está formulada con vectores AAV. En este trabajo se utilizaron vectores scAAV2 que codifican un ALDH2 shRNA, para silenciar la expresión del gen de ALDH2 en líneas celulares humanas. Las líneas celulares HEK-293 y HepG2 se infectaron con el virus scAAV2/shRNA resultando en una reducción de la expresión de ALDH2 a nivel de RNA y proteínas en las dos concentraciones virales probadas (1x104 y 1x105 vg/cel) cada una probada en dos periodos de tiempos. En ambas líneas celulares los niveles de RNA de ALDH2 se redujeron en un 90% y la expresión a nivel proteico se inhibió en un 90% y 52% respectivamente, cinco días después de la infección. Las células HepG2 VL17A (ADH+) tratadas y expuestas a etanol mostraron un aumento de hasta el 50% en los niveles de acetaldehído. Estos resultados sugieren que la terapia génica puede ser una herramienta útil para el tratamiento del alcoholismo, a través del silenciamiento de la expresión de ALDH2 utilizando tecnología shRNA entregada las células por vectores AAV.
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Terapia Génica por Vectores Adenovirales en Modelos Animales de Alcoholismo: Inhibición de la Expresión del Gen de la Deshidrogenasa Aldehídica Mitocondrial Mediante un Gen Antisentido

Ocaranza Osses, Paula January 2006 (has links)
Doctor en Bioquímica / El alcoholismo es una enfermedad de etiología multifactorial que causa un número de problemas sociales, laborales, legales y médicos. El riesgo de un individuo de desarrollar alcoholismo está influenciado por varios genes. Algunos genes permiten el desarrollo del alcoholismo y otros genes protegen a sus portadores de esta condición. La deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) metaboliza gran parte del acetaldehído generado en el metabolismo hepático del alcohol. En algunos individuos de la población asiática, una mutación en el gen que codifica la ALDH2, disminuye o elimina la actividad de esta enzima. La inactivación de esta enzima produce una exagerada acumulación del acetaldehído sanguíneo luego del consumo de bebidas alcohólicas, lo que genera efectos disfóricos que producen un rechazo al alcohol. Este fenotipo protector descrito en la población asiática puede ser producido en alcohólicos a los cuales se ha administrado el medicamento aversivo disulfiram (Antabus®). Este fármaco, eficaz en disminuir la actividad ALDH2, es sin embargo poco específico, posee una vida media corta, muestra una gran variabilidad individual y genera una serie de efectos tóxicos por unirse en forma no específica a los grupos sulfhidrilos de varias proteínas. La terapia génica se perfila como una alternativa al actual tratamiento farmacológico del alcoholismo. Un nuevo medicamento aversivo sin los efectos secundarios del disulfiram sería de gran utilidad en el campo del alcoholismo. El tipo de terapia a desarrollar pretende imitar el fenotipo asiático, disminuyendo específicamente la actividad de la ALDH2 mediante la reducción de la traducción del mRNA. La estrategia utilizada para lograr este objetivo, es inhibir la traducción mediante la generación de un RNA antisentido de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial codificado en un vector adenoviral. En estudios en esta tesis, primeramente, el gen antisentido de la ALDH2 (cDNA de Aldh2 en posición 3’ a 5’) contenido en el vector adenoviral bajo el promotor CMV se transdujo a células de hepatoma de rata generando niveles altos de mRNA antisentido. La administración de este vector a células de hepatoma de rata disminuyó de 60 a 70% la actividad ALDH2 y aumentó 8 veces (10 μM a 80 μM) los niveles de acetaldehído acumulado cuando estas células se incubaron con etanol. En estudios in vivo, se administró el adenovirus portador del gen antisentido-Aldh2 a ratas bebedoras UChB (línea de ratas Bebedoras desarrollada en la Universidad de Chile). Las ratas que recibieron una sola dosis del vector (1012 pv/kg) por vía intravenosa, disminuyeron su consumo de alcohol en 50%, y se observó una reducción de 90% en la actividad de la ALDH2. La reducción del consumo de etanol duró 34 días, tiempo al cual el estudio se finalizó. En estudios paralelos de más corta duración (10 días), los niveles plasmáticos de acetaldehído en los animales tratados con el vector anti-Aldh2 aumentó 6 a 8 veces (8 μM a 60 μM) sobre niveles controles (6-14 μM; p<0,01) asociado a un 37,5% de inhibición de la actividad ALDH2 hepática. En conclusión, en animales que reciben el gen Aldh2-antisentido, una reducción específica en la actividad de la ALDH2 permite la elevación de los niveles de acetaldehído sistémico, que genera una aversión al etanol. Los estudios sugieren que es posible desarrollar una terapia génica específica y de larga duración para el alcoholismo / Alcoholism is defined by the compulsive excessive use of alcohol despite of negative consequences perceived by the subject. It is not only one of major public health problems due to the morbidity caused by the alcohol abuse disorder but it is also a major social problem. The risk of developing this disease is genetically influenced, with some genes being permissive and other genes protective. Most of the elimination of ethanol occurs by oxidation to acetaldehyde and further into acetate. The reactions are sequentially catalyzed by alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). The oxidation of acetaldehyde to acetate is catalyzed primarily by ALDH2, the low Km isozyme of ALDH present in mitochondria. A mutation in the gene coding for ALDH2 present in some Asian populations, lowers or abolishes the activity of this enzyme and results in marked elevations in blood acetaldehyde upon ethanol consumption. The resulting phenotype greatly protects against alcohol abuse and alcoholism. The protective Asian phenotype can be elicited in alcoholics who are administered the aversive medication disulfiram (Antabuse®), affording these individuals the same protection from alcohol abuse. However, disulfiram is a non-specific drug that binds to sulfhydryl groups, has a short half-life, cannot be metabolized by some patients into its active metabolite, and has marked toxicity side effects, as it nonspecifically binds to sulfhydryl groups in other proteins. Gene therapy, as a new approach, opens the possibility of developing a specific aversive medication for alcoholism. This new treatment, based on the reduction of Aldh2 mRNA transduction, provides a means by which gene expression can be specifically inhibited to yield the low-ALDH2 Asian phenotype. The aim of the work presented in this thesis is to reduce Aldh2 mRNA translation in the rat by the intracellular generation of an antisense aldehyde dehydrogenase RNA coded by an antisense gene (Aldh2 cDNA in a 3´ to 5´ orientation) contained in an adenoviral vector. Rat hepatoma cells were transduced with the antisense coding gene against ALDH2 carried by the adenoviral vector, leading to the generation of high levels of antisense mRNA. The cells infected with this vector, reduced their ALDH2 activity by 60 to 70% and, in the presence of ethanol, increased 8-fold the levels of acetaldehyde (10 μM to 80 μM). In studies in vivo, the adenoviral vector coding for the antisense-Aldh2 RNA was administered to UChB rats (University of Chile alcohol dependent rats). The rats infected with a single dose of the vector (1012 vp/kg) by tail vein injection inhibited its ALDH2 activity in 90% and reduced its alcohol consumption in 50%. The reduction in alcohol consumption lasted 34 days, time at which the study was terminated. A parallel study in which rats were infected 10 days earlier with a single dose of the vector carrying the antisense gene showed a 37.5% reduction in hepatic ALDH2 activity, while acetaldehyde plasma levels following the administration of ethanol increased 6-8 fold over controls (5-10 μM to 40-60 μM) (p<0,01). Overall, rats treated with an Aldh2- antisense coding gene show significant reductions in hepatic ALDH2 activity and elevations in systemic acetaldehyde upon ethanol administration, which are accompanied by marked reductions in ethanol voluntary consumption in alcohol dependent animals. These preclinical studies suggest that a long-lasting specific gene therapy against alcoholism may be developed

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