Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-15T15:42:29Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_KarineFigueiredoAndrade.pdf: 2642799 bytes, checksum: b0e5e80dabb84b6d64996da26c9f430b (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-26T16:49:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_KarineFigueiredoAndrade.pdf: 2642799 bytes, checksum: b0e5e80dabb84b6d64996da26c9f430b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-26T16:49:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_KarineFigueiredoAndrade.pdf: 2642799 bytes, checksum: b0e5e80dabb84b6d64996da26c9f430b (MD5) / Os receptores nucleares (NRs) são de grande importância para o mercado mundial de fármacos por estarem envolvidos em mecanismos que influenciam diversas doenças que afetam a humanidade como, por exemplo, o Diabetes Mellitus (DM2), dislipidemia, aterosclerose, obesidade. Dentre os NRs, os Receptores Ativados por Proliferadores Peroxissomais (PPARs) e os Receptores do Hormônio Tireoideano (TRs) controlam importantes ações fisiológicas como regulação de processos inflamatórios, homeostase de glicose e lipídios (PPAR), diferenciação e crescimento celular e metabolismo (TR). Atualmente, o tratamento do DM2 é feito majoritariamente com tiazolidinadionas (TZD), classe de fármacos que diminui a resistência insulínica. A terapia com hormônio tireoideano (HT) para reduzir o colesterol sérico apresenta limitações terapêuticas e efeitos cardíacos indesejáveis. Os compostos sintetizados nesse trabalho: (4-formil-3,5-dimetilfenóxi)-acetoacetato de etila (KF01), (2-formil-3,5-dimetilfenóxi)-acetoacetato de etila (KF02) e o (3,5-dimetilfenóxi)-acetoacetato de etila (KF03) foram submetidos a ensaios para avaliar sua atividade biológica. No ensaio de toxicidade utilizando larvas de Artemia salina, todos os compostos avaliados apresentaram atividade e o composto KF03 mostrou-se 5,7 vezes mais ativo que o padrão positivo (K2Cr2O7). Esse resultado indica que KF01, KF02 e KF03 possuem atividade citotóxica contra larvas de Artemia salina. Os ensaios de transfecção e generepórter em culturas de células U937, mostraram que KF02 apresentou ação panagonista mediada pelas três isoformas do PPAR (α, β/δ e γ), além de efeito sinérgico na presença de bezafibrato e de rosiglitazona (agonistas sintéticos do PPAR), KF03 apresentou um duplo agonismo na transcrição mediada por PPARα e PPARγ, e atuou sinergicamente com os ligantes sintéticos desses receptores. Nos receptores do hormônio tireoideano (TRα e TRβ), foi verificada ação agonista de KF02 e efeito sinérgico de KF01, KF02 e KF03 na presença do hormônio tireoideano (T3). KF02 e KF03 mostraram-se promissores quanto à atividade biológica mediada por PPAR e TR e contribuem para trabalhos futuros no desenvolvimento de pan e duplo agonistas de PPAR e ainda na busca de tiromiméticos β-seletivos capazes de atuar no controle do DM2, obesidade, aterolsclerose e dislipidemia. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nuclear receptors (NRs) are of great importance for the worldwide drug market since they are involved in mechanisms which influence several diseases that affect humanity like, for instance, diabetes mellitus (DM2), obesity, dislypemia and atherosclerosis. Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR) and Thyroid Hormone Receptors (TR) control important physiologic actions as the regulation of inflammatory processes, glucose and lipid homeostasis (PPAR), differentiation and cellular growth and metabolism (TR). Currently, the DM2 treatment is carried mainly by thiazolidinediones (TZD), a pharmacon category that reduces the insulin resistance. The therapy with thyroid hormone (TH) to reduce the serum cholesterol shows therapeutical limitations and undesirable cardiac effects. The compounds synthesized in this project: (4-phormyl-3,5- dimethylphenoxi)-acet ethyl acetate (KF01), (2-phormyl-3,5-dimethylphenoxi)-acet ethyl acetate (KF02) and (3,5-dimethylphenoxi)-acet ethyl acetate (KF03), were submitted to trials to evaluate its biological activity. In the cytotoxicity test, using Artemia salina larvae, all compounds evaluated presented activity and the compound KF03 showed itself 5.7 more active then the positive pattern (K2Cr2O7). This result indicates that KF01, KF02 and KF03 have antitumor activity. In the transfection and reporter gene trials in cell culture (U937 cells), the results showed that KF02 presented a pan-agonist action mediated by the three PPAR isoforms (α, β/δ and γ), besides a synergic effect in the presence of bezafibrate and rosiglitazone (PPAR synthetic ligants), KF03 presented a double agonism in the transcription mediated by PPARα and γ, and acted synergically with the synthetic ligants of these receptors. In the thyroid hormone receptors (TRα and TRβ), it was verified an agonist action of KF02 and a synergic effect of KF01, KF02 and KF03 in the presence of the thyroid hormone (T3). The B fragment derivatives (KF02 and KF03) showed themselves promising due to their biological activity mediated by PPAR and TR and these findings contribute to future studies in the development of pan and double PPAR agonists and also in the search for β-selective thyromimetic substances able to act in the metabolic syndrome control.

Os hormônios tireoidianos estão envolvidos em vários efeitos regulatórios, em órgãos diversos. Suas variações no organismo estão relacionadas a quadros clínicos de grande relevância. A presente dissertação trata do estudo de duas proteínas diretamente relacionadas ao complexo sistema regulatório associado a tais hormônios. A primeira delas é a globulina de ligação à tiroxina (TBG), responsável pelo transporte da grande maioria dos hormônios tireoidianos circulantes, e cujas alterações estão relacionadas a falhas na interpretação de testes de avaliação da função tireoidiana, podendo levar a tratamentos desnecessários. A segunda proteína é o receptor tireoidiano (TR), responsável pela mediação dos efeitos regulatórios do hormônio tireoidiano, tendo sua estimulação de atividade transcricional relacionada à ligação do hormônio em um de seus domínios. A TBG foi estudada através da técnica computacional conhecida como modelagem molecular por homologia, aplicada à proteína em sua forma selvagem e a mutantes observados no Brasil, com o intuito de relacionar a inviabilidade de tais mutantes a aspectos estruturais. Foi proposto que, para dois dos mutantes estudados, a formação das estruturas secundárias como na forma nativa da proteína seria inviável, enquanto que para o terceiro mutante a inviabilidade poderia ser causada por enovelamento incorreto causado por uma possível interação entre um resíduo de cisteína adveniente da mutação e outros resíduos do mesmo aminoácido em posição fisicamente próxima. O estudo do TR teve como base as estruturas cristalográficas das duas isoformas humanas do receptor (hTR α e hTR β) quando ligadas ao tiromimético GC-1. Esse composto tem a propriedade de ligar-se preferencialmente à isoforma β, o que pode ter interessantes aplicações farmacológicas. A análise comparativa da ligação do GC-1 às duas isoformas mostrou que, para tal composto, a seletividade se deve a mudanças consideráveis no modo de ligação ao hTR α e hTR β. Para a isoforma , há dois modos de ligação, envolvendo conformações alternativas de ligante e proteína, onde em uma delas a ligação é mais favorável e semelhante à ligação do composto à isoforma , enquanto no outro modo de ligação há a perda de uma interação direta entre composto e proteína, explicando a mais baixa afinidade do GC-1 à isoforma quando comparado à isoforma . O mecanismo de -seletividade para esse composto está relacionado a um átomo de oxigênio específico que não existe no ligante natural do receptor, o que fornece úteis informações para a criação de novos compostos. / The thyroid hormones are involved in various regulatory effects, on diverse organs. Their fluctuations on the body are related to clinical scenarios of great relevance. This work deals with the study of two proteins which are directly related to the regulatory system associated to these hormones. The first one is the thyroxine-binding globulin (TBG), responsible for the transport of a large part of the thyroid hormones in serum, and whose variations are related to misinterpretation of thyroid function tests. The second protein is the thyroid receptor (TR), responsible for the mediation of the thyroid hormone regulatory effects . the transcriptional activity being related to ligand binding to one of the protein domains. The wild-type TBG and three mutants discovered in Brazil were studied by the computational technique known as homology modeling. The purpose of this investigation was to relate protein unviability to structural aspects. It was proposed that, for two mutants, the unviability was related to the impossibility of secondary structure formation as needed to form the native folding, while the third mutant the cause could be the formation of an incorrect folding due to possible interactions involving a cysteine residue created by the mutation and other nearby cysteine residues. The thyroid receptor was studied in the light of the x-ray structures of the two isoforms of the protein (hTR α and hTRβ) bound to GC-1, a synthesized compound which resembles the thyroid hormones. This ligand binds preferably the isoform, a feature that may have interesting pharmacological applications. The comparative analysis of GC-1 binding to the two isoforms allowed the construction of a structural basis of its -selectivity property, which is due to considerable differences in the binding modes for the two isoforms. This involves two different configurations of ligand and protein conformations for the isoform - on one of them, the ligand docks to the molecule the same way it docks to hTRβ, while on the second configuration it loses one direct interaction to the protein, explaining its lower affinity to hTR α when compared to hTRβ. The -selectivity mechanism for this compound is related to a specific oxygen atom which doesn?t exist on the receptor endogenous ligand, providing useful information for the development of new compounds.

Os hormônios tireoidianos estão envolvidos em vários efeitos regulatórios, em órgãos diversos. Suas variações no organismo estão relacionadas a quadros clínicos de grande relevância. A presente dissertação trata do estudo de duas proteínas diretamente relacionadas ao complexo sistema regulatório associado a tais hormônios. A primeira delas é a globulina de ligação à tiroxina (TBG), responsável pelo transporte da grande maioria dos hormônios tireoidianos circulantes, e cujas alterações estão relacionadas a falhas na interpretação de testes de avaliação da função tireoidiana, podendo levar a tratamentos desnecessários. A segunda proteína é o receptor tireoidiano (TR), responsável pela mediação dos efeitos regulatórios do hormônio tireoidiano, tendo sua estimulação de atividade transcricional relacionada à ligação do hormônio em um de seus domínios. A TBG foi estudada através da técnica computacional conhecida como modelagem molecular por homologia, aplicada à proteína em sua forma selvagem e a mutantes observados no Brasil, com o intuito de relacionar a inviabilidade de tais mutantes a aspectos estruturais. Foi proposto que, para dois dos mutantes estudados, a formação das estruturas secundárias como na forma nativa da proteína seria inviável, enquanto que para o terceiro mutante a inviabilidade poderia ser causada por enovelamento incorreto causado por uma possível interação entre um resíduo de cisteína adveniente da mutação e outros resíduos do mesmo aminoácido em posição fisicamente próxima. O estudo do TR teve como base as estruturas cristalográficas das duas isoformas humanas do receptor (hTR α e hTR β) quando ligadas ao tiromimético GC-1. Esse composto tem a propriedade de ligar-se preferencialmente à isoforma β, o que pode ter interessantes aplicações farmacológicas. A análise comparativa da ligação do GC-1 às duas isoformas mostrou que, para tal composto, a seletividade se deve a mudanças consideráveis no modo de ligação ao hTR α e hTR β. Para a isoforma , há dois modos de ligação, envolvendo conformações alternativas de ligante e proteína, onde em uma delas a ligação é mais favorável e semelhante à ligação do composto à isoforma , enquanto no outro modo de ligação há a perda de uma interação direta entre composto e proteína, explicando a mais baixa afinidade do GC-1 à isoforma quando comparado à isoforma . O mecanismo de -seletividade para esse composto está relacionado a um átomo de oxigênio específico que não existe no ligante natural do receptor, o que fornece úteis informações para a criação de novos compostos. / The thyroid hormones are involved in various regulatory effects, on diverse organs. Their fluctuations on the body are related to clinical scenarios of great relevance. This work deals with the study of two proteins which are directly related to the regulatory system associated to these hormones. The first one is the thyroxine-binding globulin (TBG), responsible for the transport of a large part of the thyroid hormones in serum, and whose variations are related to misinterpretation of thyroid function tests. The second protein is the thyroid receptor (TR), responsible for the mediation of the thyroid hormone regulatory effects . the transcriptional activity being related to ligand binding to one of the protein domains. The wild-type TBG and three mutants discovered in Brazil were studied by the computational technique known as homology modeling. The purpose of this investigation was to relate protein unviability to structural aspects. It was proposed that, for two mutants, the unviability was related to the impossibility of secondary structure formation as needed to form the native folding, while the third mutant the cause could be the formation of an incorrect folding due to possible interactions involving a cysteine residue created by the mutation and other nearby cysteine residues. The thyroid receptor was studied in the light of the x-ray structures of the two isoforms of the protein (hTR α and hTRβ) bound to GC-1, a synthesized compound which resembles the thyroid hormones. This ligand binds preferably the isoform, a feature that may have interesting pharmacological applications. The comparative analysis of GC-1 binding to the two isoforms allowed the construction of a structural basis of its -selectivity property, which is due to considerable differences in the binding modes for the two isoforms. This involves two different configurations of ligand and protein conformations for the isoform - on one of them, the ligand docks to the molecule the same way it docks to hTRβ, while on the second configuration it loses one direct interaction to the protein, explaining its lower affinity to hTR α when compared to hTRβ. The -selectivity mechanism for this compound is related to a specific oxygen atom which doesn?t exist on the receptor endogenous ligand, providing useful information for the development of new compounds.