Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Mutations in the TAT gene cause tyrosinaemia type II (Richner–Hanhart syndrome). It is an autosomal recessive disorder caused by, producing a TAT enzyme with decreased or inexistent activity, which leads to increased blood tyrosine levels and clinical manifestations such as keratitis and/or painful palmoplantar hyperkeratotic lesions and inflammations in the eyes. Neurological manifestations are variable and some patients are developmentally normal, while others show different degrees of developmental retardation. Considering that increased blood tyrosine levels cause neurological manifestations and that the mechanisms responsible by this alterations are poorly understood, In the present study, we evaluated the effects of L-tyrosine administration on the activities of enzymes citrate synthase, malate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, and complexes I, II, II-III, and IV of mitochondrial respiratory chain in the posterior cortex, hippocampus and striatum of rats with 10-day-old. Wistar rats were killed one hour after a single intraperitoneal injection of either tyrosine (500 mg/kg) or saline. The activities of energy metabolism enzymes were evaluated. Our results demonstrated that the acute administration of L-tyrosine in rats with 10-day-old inhibited the citrate synthase enzyme and the complex I and II activity of the mitochondrial respiratory chain in the striatum. The succinate dehydrogenase enzyme and the complex II-III activity were increased in the hippocampus. Furthermore, the malate dehydrogenase and the complex IV activity were not altered by an acute administration of L-tyrosine. In particular, several groups report that systemically administered tyrosine is differentially distributed across brain regions. In conclusion, our results indicate that an alteration in the energetic metabolism of the hippocampus and striatum can leads to damage in the involved in acquisition, retrieval, consolidation and storage of memory, and cognitive processes after the acute administration of L-tyrosine in young rats. Thus our results contribute to a better knowledge of the pathophysiology of hypertyrosinemia. / Mutações no gene tirosina aminotransferase (TAT) causam tirosinemia tipo II (síndrome de Richner-Hanhart) é uma doença autossômica recessiva causada pela atividade reduzida ou inexistente da enzima tirosina aminotransferase, o que leva a um aumento dos níveis sanguíneos de tirosina e manifestações clínicas como ceratite, lesões palmo plantares dolorosas e hiperqueratose e inflamações nos olhos. As manifestações neurológicas são variáveis e alguns pacientes tem desenvolvimento normal, enquanto outros mostram diferentes graus de retardo no desenvolvimento. Considerando que aumento dos níveis de tirosina no sangue, causam manifestações neurológicas e que os mecanismos responsáveis por estas alterações são mal compreendidos. No presente estudo, foram avaliados os efeitos da administração de L-tirosina sobre a atividade das enzimas citrato sintase, malato desidrogenase, succinato desidrogenase, e complexos I, II, II-III, e IV da cadeia respiratória mitocondrial no córtex, hipocampo e estriado de ratos com 10 dias de idade. Ratos Wistar foram mortos uma hora após uma única injeção intraperitoneal de tirosina (500mg/kg) ou solução salina. As atividades das enzimas do metabolismo energético foram avaliadas. Os nossos resultados demonstram que a administração aguda de L-tirosina em ratos com 10 dias de idade, inibiu a enzima citrato sintase e a atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória mitocondrial no estriado. A enzima succinato desidrogenase e atividade do complexo II-III foram aumentadas no hipocampo. Além disso, a malato-desidrogenase e a atividade do complexo IV não foram alteradas pela administração aguda de L-tirosina. Em particular, diversos grupos relataram que a tirosina administrada sistemicamente é diferencialmente distribuída entre as regiões do cérebro. Em conclusão, os nossos resultados indicam que uma alteração no metabolismo energético do hipocampo e corpo estriado pode levar a danos no desenvolvimento na aquisição, recuperação, consolidação e no armazenamento de memória, e os processos cognitivos após a administração aguda de L-tirosina em ratos infantes. Assim, nossos resultados contribuem para um melhor conhecimento da fisiopatologia da hipertirosinemia.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. / Tyrosinemia type II is caused by autosomal recessive deficiency of the hepatic enzyme tyrosine aminotransferase. Consequently, high levels of tyrosine are found in physiological fluids and tissues of patients with tyrosinemia type II and thus develop skin lesions, ocular symptoms and/or neurological complications. Whereas the mechanisms of neurological dysfunction in patients with tyrosinemia type II are unknown , this study was investigated the neurotoxicity of L- tyrosine on energy metabolism in vitro and in vivo in rat brain and liver , as well as its effect on the levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) in rat brain . In vitro, rats 30 days of age were killed by decapitation and the brain and liver were dissected. L- tyrosine (0.1, 1.0, 2.0 or 4.0 mM) were added to the reaction medium while the control group was not added L- tyrosine , and the activity of enzymes of energy metabolism were evaluated . Acute administration to Wistar rats (10 and 30 days old) received a single intraperitoneal administration of saline or L -tyrosine (500 mg/kg) and after 1 hour were killed by decapitation. Chronic administration consisted of performing general saline or L -tyrosine (500 mg/kg) every 12 hours for 21 days in rats (7 days old). The animals were killed 12 hours after the last administration. Energy metabolism has been reported only after the acute administration of L-tyrosine in rats, 30 days old. BDNF levels and expression of the messenger ribonucleic acid (mRNA) and BDNF expression and activity of AchE and mRNA ache were evaluated after acute administration of L-tyrosine in rats of 10 and 30 days of age and after chronic administration. In this study, it was demonstrated that the effect of L- tyrosine in vitro inhibited the enzyme activity of citrate synthase in the cerebral cortex and the enzyme succinate dehydrogenase was increased in the cerebral cortex, hippocampus, striatum and liver. The complex I activity was inhibited in the hippocampus, whereas the activity of complex II was inhibited in the cerebral cortex, hippocampus and liver. The activity of complex IV was decreased in the cerebral cortex. Acute administration of L -tyrosine in rats 30 days inhibited the enzyme malate dehydrogenase, citrate synthase and complex II, III -III and IV in the cerebral cortex and liver. The activity of succinate dehydrogenase and complex I was inhibited in the cerebral cortex and increased in the striatum. The results of BDNF showed that acute administration of L-tyrosine decreased both BDNF and BDNF mRNA in the striatum of rats 10 days of age. In rats with 30 days of age, we observed a decrease in BDNF levels without changes in the level of transcription of BDNF in the hippocampus and striatum. The chronic administration of L-tyrosine increased BDNF levels in the striatum of rats during their growth, while BDNF mRNA expression was unchanged. Finally, we observed that acute administration in rats 10 and 30 days of age and chronic adminstration of L-tyrosine increased AChE activity in all brain areas evaluated, when compared to the control group. Furthermore, a significant reduction in AChE mRNA levels in the hippocampus after acute administration of L-tyrosine in rats of 10 and 30 days of age and striatum following chronic administration. Changes in energy metabolism can cause brain abnormalities, the deficit of ATP, and these changes can often be involved in oxidative stress. Thus we suggest that depletion of ATP may be associated with decreased levels of BDNF and increased AChE activity. / A tirosinemia tipo II é causada pela deficiência autossômica recessiva da enzima hepática tirosina aminotransferase. Consequentemente, altos níveis de tirosina são encontrados nos tecidos e fluidos fisiológicos de pacientes com tirosinemia tipo II e assim desenvolvem lesões cutâneas, sintomas oculares e/ou complicações neurológicas. Considerando que os mecanismos das disfunções neurológicas em pacientes com tirosinemia tipo II são pouco conhecidos, neste trabalho foi investigado a neurotoxicidade da L-tirosina sobre o metabolismo energético in vitro e in vivo em cérebro e fígado de ratos, bem como seu efeito sobre os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) em cérebro de ratos. No experimento in vitro, ratos Wistar de 30 dias de idade sofreram eutanásia por decapitação e o cérebro e fígado foram dissecados. A L-tirosina (0.1; 1.0; 2.0 ou 4.0 mM) foi adicionada ao meio de reação enquanto grupo controle não foi adicionado L-tirosina, e a atividade das enzimas do metabolismo energético foram avaliados. No experimento in vivo, ratos Wistar (10 e 30 dias de idade) receberam uma única administração intraperitoneal de salina ou L-tirosina (500 mg/kg) e após 1 hora sofreram eutanásia por decapitação. A administração crônica consistiu em realizar administrações de salina ou L-tirosina (500 mg/kg) a cada 12 horas durante 21 dias, em ratos Wistar (7 dias de idade). Os animais sofreram eutanásia 12 horas após a última administração. Foi avaliado o metabolismo energético apenas após administração aguda de L-tirosina em ratos com 30 dias de idade. Os níveis de BDNF, expressão de ácido ribonucléico mensageiro (mRNA) de bdnf, a atividade da AChE e expressão de mRNA de ache foram avaliadas após administração aguda de L-tirosina em ratos de 10 e 30 dias de idade e após administração crônica. Neste estudo, foi demonstrado que o efeito da L-tirosina in vitro inibiu a atividade da enzima citrato sintase no córtex cerebral e a enzima succinato desidrogenase foi aumentada no córtex cerebral, hipocampo, estriado e fígado. A atividade do complexo I foi inibida apenas no hipocampo, enquanto que a atividade do complexo II foi inibida no córtex cerebral, hipocampo e no fígado. A atividade do complexo IV foi diminuída no córtex cerebral. A administração aguda de L-tirosina em ratos com 30 dias de idade inibiu a enzima malato desidrogenase, citrato sintase e complexos II, II-III e IV em córtex cerebral e fígado. A atividade da succinato desidrogenase e complexo I foi inibida no córtex cerebral e aumentada no estriado. Os resultados dos níveis de BDNF mostraram que a administração aguda de L-tirosina diminuiu tanto os níveis de BDNF como mRNA de bdnf no estriado de ratos com 10 dias de idade. Nos ratos com 30 dias de idade, observamos uma diminuição dos níveis de BDNF sem modificações no nível de transcrição de BDNF no hipocampo e estriado. A administração crônica de L-tirosina aumentou os níveis de BDNF no estriado de ratos durante o seu crescimento, enquanto que a expressão de mRNA de bdnf não foi alterada. Por fim, observamos que a administração aguda em ratos de 10 e 30 dias de idade e adminstração crônica de L-tirosina aumentou a atividade da AChE em todas as áreas do cérebro avaliadas, quando comparados ao grupo controle. Além disso, houve uma diminuição significativa nos níveis de mRNA de ache no hipocampo após administração aguda de L-tirosina em ratos de 10 e 30 dias de idade e no estriado após administração crônica. Juntos, estes resultados mostram que alterações no metabolismo energético podem provocar anormalidades cerebrais, pelo déficit de ATP, e essas alterações muitas vezes podem estar envolvidas com a presença de estresse oxidativo. Desta forma sugerimos que a depleção da ATP pode estar associada com a diminuição dos níveis de BDNF e o aumento da atividade da AChE.

Para otimizar um modelo experimental para o estudo do desbalanço redox em porfirias relacionadas ao acúmulo de ácido 5-aminolevulínico-(ALA), via inibição da ALA desidratase-(ALA-D), ratos foram tratados com o éster metílico de succinilacetona-(SAME), um catabólito da tirosina que inibe fortemente a ALA-O, mimetízando o estado metabólico observado nos portadores de portirias e tirosinemias. Estabeleceram-se modelos de tratamento agudo por 36 e 18 h. No primeiro, os animais receberam 3 injeções de SAME (10, 40 ou 80 mg/kg, grupos Ali-IV). No segundo, os animais receberam 3 injeções de 40 mg/kg de SAME, ALA ou éster metílico de ALA (grupos BII-IV), ALA:SAME (30: 10 mg/kg, grupo BV), ou 10 mg/kg SAME (grupo BVI). Paralelamente, avaliou-se se os sintomas neurológicos característicos das portirias decorriam de danos oxidativos mitocondriais. Para isso, aplicou-se uma tecnologia óptica para medidas da difusão da depressão cortical que determinou a oxigenação e o estado redox do cit c em mitocôndrias do córtex cerebral de ratos submetidos ao tratamento crônico com ALA (40 mg/kg), SAME (10 e 40 mg/kg) e ALA:SAME (30: 1O mg/kg), a cada 48 h, durante 30 dias. Tratamento agudo/36 h: Os níveis de ALA no plasma, fígado, cérebro e urina e o clearance renal do ALA aumentaram nos grupos tratados. A atividade de ALA-D e a coproporfirina urinária reduziram. A marcação para proteínas carboniladas, ferro e ferritina aumentou no fígado e cérebro dos grupos tratados, especialmente no All. Os níveis de malondialdeído hepático aumentaram no grupo AIV. A razão GSH/GSH+GSSG e a atividade de GPx cerebrais aumentaram nos grupos AIV e AIII, respectivamente. Consistentemente com estes dados indicando um desbalanço oxidativo induzido pelo SAME, alterações mitocondriais e citosólicas ultraestruturais foram reveladas, especialmente no fígado. Tratamento agudo/18 h: Os níveis de ALA plasmáticos aumentaram nos grupos tratados, exceto em BIV. O grupo BII mostrou aumento dos níveis hepáticos de ALA. Interessantemente, a inibição da atividade de ALA-D não foi evidenciada. O conteúdo de ferro plasmático aumentou no grupo BII. Para os grupos tratados com 10 e 40 mg SAME/kg, a atividade de SOD hepática reduziu ~50% com a extensão do tratamento de 18 para 36 h, sugerindo que este último é mais efetivo em promover danos oxidativos induzidos pelo ALA. Tratamento crônico/30 dias: Embora nenhuma alteração tenha sido evidenciada no estado redox dos animais tratados, o tratamento com ALA reduziu o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) e o consumo de oxigênio-(CMRO2), sugerindo uma vasoconstrição mediada pelo ALA, efeito este confirmado por ensaios de reatividade vascular conduzidos em anéis de aorta de ratos incubados com ALA. O tratamento com ALA:SAME restaurou os níveis de CBF e CMRO2. Interessantemente, a disponibilidade do radical superóxido-(O2•-) estava reduzida nos anéis de aorta incubados com ALA. Juntos, estes dados: a)validam o modelo de tratamento agudo/36 h para o estudo bioquímico e dos possíveis efeitos fisiológicos induzidos pelo ALA, e b)sugerem que as alterações mediadas pelo ALA exógeno levam à vasoconstrição. / To optimize an experimental model for studying redox imbalance in porphyrias related to 5-aminolevulinic acid (ALA) accumulation through the inhibition of ALA dehydratase (ALA-D), rats were treated with methyl ester of succinylacetone (SAME), a tyrosine catabolite that strongly inhibits ALA-D, what mimics the metabolic state observed in patients suffering from porphyrías and tyrosinemias. Models of acute treatment were established during 36 and 18 h. In the first model, animals received 3 injections of SAME (10, 40 or 80 mg/kg, groups Ali-IV). In the second model, animals received 3 injections of 40 mg/kg SAME, ALA or methyl ester of ALA (groups BII-IV), ALA:SAME (30:10 mg/kg, group BV), or 10 mg/kg SAME (group BVI). Concomitantly, we evaluated if the neurologic symptoms characteristics of porphyrias were a consequence of the oxidative mitochondrial impairment. For this, an optical technology for the measurement of cortical spreading depression was applied. This techonology determined the cerebral oxygenation and the redox state of cit c in mitochondria of the cerebral cortex of rats submitted to a chronic treatment with ALA (40 mg/kg), SAME (10 and 40 mg/kg) and ALASAME (30:10 mg/kg), alternate days, during 30 days. Acute treatment/36 h: ALA levels in plasma, liver and urine and clearance of renal ALA increased in treated groups. ALA-D activities and urinary coproporphyrin were found to be decreased. Liver and brain proteins carbonyl, iron and ferritin were higher in the liver of treated groups, especially in All. Liver malondialdehyde levels were higher in group AIV. Cerebral GSH/GSH+GSSG ratio and GPx activities increased in groups AIV and AIII, respectively. Consistently with these data indicating SAME-induced oxidative imbalance, mitochondrial and cytosolic ultrastructural changes were revealed, especially in the liver. Acute treatment/18 h: Plasma ALA levels increased in all treated groups but BIV. Group BII showed increased hepatic ALA levels. Interestingly, inhibition in ALA-D activities was not evidenced. Plasma iron content increased in group BII. For the groups treated with 10 and 40 mg SAME/kg, liver SOD activities reduced ~50% by extending the treatment from 18 to 36 h, suggesting that the latter is more effective in ALA-induced oxidative damage. Chronic treatment /30 days: Despite no changes in the redox state of treated animals were observed, the treatment with ALA reduced the cerebral blood flow (CBF) and the consumption of oxygen (CMRO2), suggesting a vasoconstriction mediated by ALA. This effetc was confirmed by vascular reactivity assay performed in aortic rings of rats incubated with ALA. The treatment with ALA:SAME recovered the CBF and CMRO2 levels. Interestingly, the availability of superoxide radical (O2•-) was reduced in the aortic rings incubated with ALA. Altogether, these data a) validate the model of acute treatment/36 h for studying biochemical and possibly physiological effects induced by ALA, and b)suggest that the changes mediated by exogenous ALA lead to vasoconstriction.

Para otimizar um modelo experimental para o estudo do desbalanço redox em porfirias relacionadas ao acúmulo de ácido 5-aminolevulínico-(ALA), via inibição da ALA desidratase-(ALA-D), ratos foram tratados com o éster metílico de succinilacetona-(SAME), um catabólito da tirosina que inibe fortemente a ALA-O, mimetízando o estado metabólico observado nos portadores de portirias e tirosinemias. Estabeleceram-se modelos de tratamento agudo por 36 e 18 h. No primeiro, os animais receberam 3 injeções de SAME (10, 40 ou 80 mg/kg, grupos Ali-IV). No segundo, os animais receberam 3 injeções de 40 mg/kg de SAME, ALA ou éster metílico de ALA (grupos BII-IV), ALA:SAME (30: 10 mg/kg, grupo BV), ou 10 mg/kg SAME (grupo BVI). Paralelamente, avaliou-se se os sintomas neurológicos característicos das portirias decorriam de danos oxidativos mitocondriais. Para isso, aplicou-se uma tecnologia óptica para medidas da difusão da depressão cortical que determinou a oxigenação e o estado redox do cit c em mitocôndrias do córtex cerebral de ratos submetidos ao tratamento crônico com ALA (40 mg/kg), SAME (10 e 40 mg/kg) e ALA:SAME (30: 1O mg/kg), a cada 48 h, durante 30 dias. Tratamento agudo/36 h: Os níveis de ALA no plasma, fígado, cérebro e urina e o clearance renal do ALA aumentaram nos grupos tratados. A atividade de ALA-D e a coproporfirina urinária reduziram. A marcação para proteínas carboniladas, ferro e ferritina aumentou no fígado e cérebro dos grupos tratados, especialmente no All. Os níveis de malondialdeído hepático aumentaram no grupo AIV. A razão GSH/GSH+GSSG e a atividade de GPx cerebrais aumentaram nos grupos AIV e AIII, respectivamente. Consistentemente com estes dados indicando um desbalanço oxidativo induzido pelo SAME, alterações mitocondriais e citosólicas ultraestruturais foram reveladas, especialmente no fígado. Tratamento agudo/18 h: Os níveis de ALA plasmáticos aumentaram nos grupos tratados, exceto em BIV. O grupo BII mostrou aumento dos níveis hepáticos de ALA. Interessantemente, a inibição da atividade de ALA-D não foi evidenciada. O conteúdo de ferro plasmático aumentou no grupo BII. Para os grupos tratados com 10 e 40 mg SAME/kg, a atividade de SOD hepática reduziu ~50% com a extensão do tratamento de 18 para 36 h, sugerindo que este último é mais efetivo em promover danos oxidativos induzidos pelo ALA. Tratamento crônico/30 dias: Embora nenhuma alteração tenha sido evidenciada no estado redox dos animais tratados, o tratamento com ALA reduziu o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) e o consumo de oxigênio-(CMRO2), sugerindo uma vasoconstrição mediada pelo ALA, efeito este confirmado por ensaios de reatividade vascular conduzidos em anéis de aorta de ratos incubados com ALA. O tratamento com ALA:SAME restaurou os níveis de CBF e CMRO2. Interessantemente, a disponibilidade do radical superóxido-(O2•-) estava reduzida nos anéis de aorta incubados com ALA. Juntos, estes dados: a)validam o modelo de tratamento agudo/36 h para o estudo bioquímico e dos possíveis efeitos fisiológicos induzidos pelo ALA, e b)sugerem que as alterações mediadas pelo ALA exógeno levam à vasoconstrição. / To optimize an experimental model for studying redox imbalance in porphyrias related to 5-aminolevulinic acid (ALA) accumulation through the inhibition of ALA dehydratase (ALA-D), rats were treated with methyl ester of succinylacetone (SAME), a tyrosine catabolite that strongly inhibits ALA-D, what mimics the metabolic state observed in patients suffering from porphyrías and tyrosinemias. Models of acute treatment were established during 36 and 18 h. In the first model, animals received 3 injections of SAME (10, 40 or 80 mg/kg, groups Ali-IV). In the second model, animals received 3 injections of 40 mg/kg SAME, ALA or methyl ester of ALA (groups BII-IV), ALA:SAME (30:10 mg/kg, group BV), or 10 mg/kg SAME (group BVI). Concomitantly, we evaluated if the neurologic symptoms characteristics of porphyrias were a consequence of the oxidative mitochondrial impairment. For this, an optical technology for the measurement of cortical spreading depression was applied. This techonology determined the cerebral oxygenation and the redox state of cit c in mitochondria of the cerebral cortex of rats submitted to a chronic treatment with ALA (40 mg/kg), SAME (10 and 40 mg/kg) and ALASAME (30:10 mg/kg), alternate days, during 30 days. Acute treatment/36 h: ALA levels in plasma, liver and urine and clearance of renal ALA increased in treated groups. ALA-D activities and urinary coproporphyrin were found to be decreased. Liver and brain proteins carbonyl, iron and ferritin were higher in the liver of treated groups, especially in All. Liver malondialdehyde levels were higher in group AIV. Cerebral GSH/GSH+GSSG ratio and GPx activities increased in groups AIV and AIII, respectively. Consistently with these data indicating SAME-induced oxidative imbalance, mitochondrial and cytosolic ultrastructural changes were revealed, especially in the liver. Acute treatment/18 h: Plasma ALA levels increased in all treated groups but BIV. Group BII showed increased hepatic ALA levels. Interestingly, inhibition in ALA-D activities was not evidenced. Plasma iron content increased in group BII. For the groups treated with 10 and 40 mg SAME/kg, liver SOD activities reduced ~50% by extending the treatment from 18 to 36 h, suggesting that the latter is more effective in ALA-induced oxidative damage. Chronic treatment /30 days: Despite no changes in the redox state of treated animals were observed, the treatment with ALA reduced the cerebral blood flow (CBF) and the consumption of oxygen (CMRO2), suggesting a vasoconstriction mediated by ALA. This effetc was confirmed by vascular reactivity assay performed in aortic rings of rats incubated with ALA. The treatment with ALA:SAME recovered the CBF and CMRO2 levels. Interestingly, the availability of superoxide radical (O2•-) was reduced in the aortic rings incubated with ALA. Altogether, these data a) validate the model of acute treatment/36 h for studying biochemical and possibly physiological effects induced by ALA, and b)suggest that the changes mediated by exogenous ALA lead to vasoconstriction.