For more than 80 years vitamin E has been in the focus of scientific research. Most of the progress concerning non-antioxidant functions, nevertheless, has only arisen from publications during the last decade.<br> Most recently, the metabolic pathway of vitamin E has been almost completely elucidated. Vitamin E is metabolized by truncation of its side chain. The initial step of an omega-hydroxylation is carried out by cytochromes P450 (CYPs). This was evidenced by the inhibition of the metabolism of alpha-tocopherol by ketoconozole, an inhibitor of CYP3A expression, whereas rifampicin, an inducer of CYP3A expression increased the metabolism of alpha-tocopherol. Although the degradation pathway is identical for all tocopherols and tocotrienols, there is a marked difference in the amount of the release of metabolites from the individual vitamin E forms in cell culture as well as in experimental animals and in humans. Recent findings not only proposed an CYP3A4-mediated degradation of vitamin E but also suggested an induction of the metabolizing enzymes by vitamin E itself.<br> In order to investigate how vitamin E is able to influence the expression of metabolizing enzymes like CYP3A4, a pregnane X receptor (PXR)-based reporter gene assay was chosen. PXR is a nuclear receptor which regulates the transcription of genes, e.g., CYP3A4, by binding to specific DNA response elements. And indeed, as shown here, vitamin E is able to influence the expression of CYP3A via PXR in an in vitro reporter gene assay. Tocotrienols showed the highest activity followed by delta- and alpha-tocopherol. An up-regulation of Cyp3a11 mRNA, the murine homolog of the human CYP3A4, could also be confirmed in an animal experiment. The PXR-mediated change in gene expression displayed the first evidence of a direct transcriptional activity of vitamin E. PXR regulates the expression of genes involved in xenobiotic detoxification, including oxidation, conjugation, and transport. CYP3A, e.g., is involved in the oxidative metabolism of numerous currently used drugs. This opens a discussion of possible side effects of vitamin E, but the extent to which supranutritional doses of vitamin E modulate these pathways in humans has yet to be determined. <br><br> Additionally, as there is arising evidence that vitamin E's essentiality is more likely to be based on gene regulation than on antioxidant functions, it appeared necessary to further investigate the ability of vitamin E to influence gene expression. Mice were divided in three groups with diets (i) deficient in alpha-tocopherol, (ii) adequate in alpha-tocopherol supply and (iii) with a supranutritional dosage of alpha-tocopherol. After three months, half of each group was supplemented via a gastric tube with a supranutritional dosage of gamma-tocotrienol per day for 7 days. Livers were analyzed for vitamin E content and liver RNA was prepared for hybridization using cDNA array and oligonucleotide array technology. A significant change in gene expression was observed by alpha-tocopherol but not by gamma-tocotrienol and only using the oligonucleotide array but not using the cDNA array. The latter effect is most probably due to the limited number of genes represented on a cDNA array, the lacking gamma-tocotrienol effect is obviously caused by a rapid degradation, which might prevent bioefficacy of gamma-tocotrienol.<br> Alpha-tocopherol changed the expression of various genes. The most striking observation was an up-regulation of genes, which code for proteins involved in synaptic transmitter release and calcium signal transduction. Synapsin, synaptotagmin, synaptophysin, synaptobrevin, RAB3A, complexin 1, Snap25, ionotropic glutamate receptors (alpha 2 and zeta 1) were shown to be up-regulated in the supranutritional group compared to the deficient group. The up-regulation of synaptic genes shown in this work are not only supported by the strong concentration of genes which all are involved in the process of vesicular transport of neurotransmitters, but were also confirmed by a recent publication. However, a confirmation by real time PCR in neuronal tissue like brain is now required to explain the effect of vitamin E on neurological functionality. The change in expression of genes coding for synaptic proteins by vitamin E is of principal interest thus far, since the only human disease directly originating from an inadequate vitamin E status is ataxia with isolated vitamin E deficiency. Therefore, with the results of this work, an explanation for the observed neurological symptoms associated with vitamin E deficiency can be presented for the first time. / Chemisch handelt es sich bei Vitamin E um acht lipophile Derivate des 6 Chromanols mit einer Seitenkette. Nach dem Sättigungsgrad der Seitenkette lassen sich die Derivate in die Tocopherole (gesättigte Seitenkette) und die Tocotrienole (ungesättigte Seitenkette mit drei Doppelbindungen) einteilen. Entsprechend der Methylierung des Chromanrings lassen sie sich in alpha-, beta-, gamma- und delta-Tocopherol, bzw. Tocotrienol unterscheiden. Davon besitzt alpha-Tocopherol, das gleichzeitig die im Plasma dominierende Form darstellt, die höchste biologische Aktivität. Aufnahme wie auch der Transport von Vitamin E im Körper sind vergleichsweise gut erforscht. Die Kenntnisse zu Metabolismus und Elimination waren jedoch bis vor kurzem sehr lückenhaft. Lange Zeit waren nur Vitamin E-Metabolite mit geöffnetem Chromanring, die sogenannten Simon-Metabolite Tocopheronsäure und Tocopheronolacton bekannt. Diese Metabolite können nur aus oxidativ gespaltenem Vitamin E entstehen und galten daher auch als Beweis für die antioxidative Wirkung von Vitamin E. Mit verbesserter Analytik wurde vor einigen Jahren gezeigt, dass die Simon-Metabolite größtenteils Isolierungsartefakte sind. Stattdessen wurden Metabolite mit intaktem Chromanring identifiziert. Tocopherole wie auch Tocotrienole werden im Körper durch eine Verkürzung der Seitenkette abgebaut. Die Endprodukte sind in jedem Fall CEHCs (Carboxyethyl Hydroxychromane). Die Seitenkettenverkürzung startet mit einer omega-Hydroxylierung gefolgt von 5 Schritten &#61472;beta-Oxidation. Die omega Hydroxylierung der Seitenkette durch Cytochrom P450 (CYP) Enzyme wurde indirekt bestätigt. CYP3A4 gilt dabei als eines der wahrscheinlichsten Enzyme im Abbau von Vitamin E, die Beteiligung weiterer CYPs wird jedoch gleichfalls angenommen. Auffällig ist, dass nicht alle Vitamin E-Formen in gleichem Ausmaß abgebaut werden. Die Ausscheidung von CEHCs aus alpha-Tocopherol ist, verglichen zu andern Vitamin E-Formen, in kultivierten Zellen wie auch in vivo sehr gering. Die Art der Seitenkettenverkürzung von Vitamin E spricht für einen Abbau über das Fremdstoff-metabolisierende System, welches auch eine Vielzahl von Medikamenten verstoffwechselt.<br> Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte mittels Reportergenassay in HepG2 Zellen gezeigt werden, dass Vitamin E einen nukleären Rezeptor, den Pregnan X Rezeptor (PXR), zu aktivieren und die Expression von PXR-regulierten Genen zu beeinflussen vermag. PXR reguliert eine Reihe von Genen für Fremdstoff-metabolisierende Enzyme wie z.B. Cytochrom P450 3A4 durch Bindung an sein responsives Element im Promotor der Zielgene. Die untersuchten Vitamin E-Formen unterschieden sich deutlich hinsichtlich ihrer PXR-Aktivierung. Die Tocotrienole zeigten die höchste PXR-Aktivierung - vergleichbar mit Rifampicin, einem bekannt guten PXR-Aktivator - gefolgt von delta / alpha- und gamma-Tocopherol. Im Tierversuch an Mäusen konnte die erhöhte Expression von Cyp3a11, dem Homolog des humanen CYP3A4 in Abhängigkeit von der alpha-Tocopherol-Zufuhr bestätigt werden. Somit konnte erstmals gezeigt werden, dass Vitamin E die Expression von Genen direkt beeinflussen kann. Darüber hinaus unterstreicht diese Beobachtung die Möglichkeit einer Wechselwirkung von pharmakologischen Dosen Vitamin E mit dem Abbau von Medikamenten. Eine genregulatorische Funktion von Vitamin E ist auf den ersten Blick überraschend. Denn wenngleich Vitamin E vor über 80 Jahren als Fertilitätsfaktor bei Ratten entdeckt wurde, steht die erst später beschriebene antioxidative Eigenschaft von Vitamin E bis heute im Fokus der meisten Publikationen. Die molekularen Mechanismen der Essentialität von Vitamin E wurden dagegen wenig untersucht. Erst in den letzten Jahren finden Funktionen von Vitamin E Interesse, die über seine antioxidative Wirkung hinausgehen. Dabei konnte gezeigt werden, dass Vitamin E in vitro die Expression von Genen wie dem Scavenger Rezeptor CD36, dem Connective Tissue Growth Factor oder dem Peroxisomen-Proliferator aktivierten Rezeptor gamma beeinflussen kann.<br> Um weitere Zielgene von Vitamin E in vivo identifizieren zu können, wurden im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit Mäuse in drei Fütterungsgruppen mit einer a) defizientem b) adäquatem sowie c) mit einer supranutritiven alpha Tocopherol-Versorgung über 3 Monate gefüttert. Zusätzlich erhielt die Hälfte der Tiere aus jeder Gruppe während der letzten Lebenswoche eine supranutritive Dosis gamma-Tocotrienol pro Tag. Aus den Lebern der Tiere wurde die RNA präpariert und die differentielle Genexpression mittels a) cDNA und b) Oligonukleotide enthaltenden GenChips analysiert.<br> Eine signifikante Änderung in der Genexpression zwischen den verschiedenen Fütterungsgruppen fand sich jedoch nur in den Analysen der Oligonukleotid GenChips. Dies kann auf die begrenzte Anzahl von Genen zurückzuführen sein, die auf den cDNA GenChips repräsentiert waren. Auch ein signifikanter Effekt von gamma-Tocotrienol auf die Genexpression konnte nicht beobachtet werden. Wahrscheinlich ist die hohe Ausscheidung von gamma-CEHC, dem Abbauprodukt von gamma-Tocotrienol, die im Urin der Tiere gemessen wurde und die damit womöglich verringerte Bioverfügbarkeit von gamma-Tocotrienol dafür verantwortlich.<br> Mit Hilfe der Oligonukleotid GenChips konnte jedoch ein signifikanter Effekt von alpha-Tocopherol auf die Expression einer Vielzahl von Genen beobachtet werden. Herausstechend war dabei die erhöhte Expression von für den vesikulären Transport essentiellen Genen, die für den synaptischen Signaltransfer benötigt werden. So wurden z.B. Synapsin, Synaptotagmin, Synaptophysin, Synaptobrevin, RAB3A, Complexin 1, Snap25, die ionotrophen Glutamat Rezeptoren alpha 2 und zeta 1 in Abhängigkeit von der alpha Tocopherol-Versorgung über die Diät erhöht exprimiert. Die Beobachtung, dass Vitamin E bei neurologischen Prozessen eine Rolle zu spielen scheint ist jedoch nicht neu. Bei Patienten mit einem Mangel an funktionellem alpha-Tocopherol-Transfer-Protein (alpha-TTP) kann es zu stark verringerten Plasmakonzentrationen an Vitamin E kommen, da alpha-TTP eine zentrale Rolle in der Aufnahme und Verteilung von Vitamin E im Körper einnimmt. An diesen Patienten können charakteristische Vitamin E-Mangelzustände beobachtet, die durch eine Reihe von neurologischen Störungen wie Ataxien, Hyporeflexie sowie eine verringerte propriozeptive und vibratorische Sensitivität gekennzeichnet sind. Mit den vorliegenden Ergebnissen kann nun erstmals eine mechanistische Erklärung für diese Symptome diskutiert werden. Eine Bestätigung der vorliegenden Ergebnisse via RT-PCR und Western Blot, z.B. in neuronalem Gewebe wie dem Gehirn, sowie anschließende funktionellen Untersuchungen ist daher dringend geboten.

Background: Ceramide synthesis and metabolism is a promising target in cancer drug development. γ-tocotrienol (GT3), a member of the vitamin E family, orchestrates multiple effects that ensure the induction of apoptosis in both, wild-type and RAS-mutated pancreatic cancer cells. Here, we investigated whether these effects involve changes in ceramide synthesis and transport. Methods: The effects of GT3 on the synthesis of ceramide via the de novo pathway, and the hydrolysis of sphingomyelin were analyzed by the expression levels of the enzymes serine palmitoyl transferase, ceramide synthase-6, and dihydroceramide desaturase, and acid sphingomyelinase in wild-type RAS BxPC3, and RAS-mutated MIA PaCa-2 and Panc 1 pancreatic cancer cells. Quantitative changes in ceramides, dihydroceramides, and sphingomyelin at the cell membrane were detected by LCMS. Modulation of ceramide transport by GT3 was studied by immunochemistry of CERT and ARV-1, and the subsequent effects at the cell membrane was analyzed via immunofluorescence of ceramide, caveolin, and DR5. Results: GT3 favors the upregulation of ceramide by stimulating synthesis at the ER and the plasma membrane. Additionally, the conversion of newly synthesized ceramide to sphingomyelin and glucosylceramide at the Golgi is prevented by the inhibition of CERT. Modulation ARV1 and previously observed inhibition of the HMG-CoA pathway, contribute to changes in membrane structure and signaling functions, allows the clustering of DR5, effectively initiating apoptosis. Conclusions: Our results suggest that GT3 targets ceramide synthesis and transport, and that the upregulation of ceramide and modulation of transporters CERT and ARV1 are important contributors to the apoptotic properties demonstrated by GT3 in pancreatic cancer cells.