Made available in DSpace on 2014-12-17T15:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 EmanuelleDVD_DISSERT.pdf: 1398010 bytes, checksum: 85e1d1f82b33da3e697eacbf6655c267 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Photodynamic therapy (PDT) has been proposed as an alternative method for the treatment of biofilm-dependent oral diseases like dental caries. This therapy consists of simultaneous action of a visible light (L) and a photosensitizer (FS) in the presence of oxygen, which leads to production of different reactive oxygen species that can interact with the bacterial cell components, and promote cell death. This study aims to evaluate the antimicrobial action of PDT on oral bacteria in suspension, as well as the formation of mono and multi-species biofilms, in vitro, from a standard strain of Streptococcus mutans (ATCC 25175) and saliva samples, respectively. The dye methylene blue (MB) and toluidine blue (TB) were used at a concentration of 100 mg/ L and activated by halogen light (600 to 750 nm) from a modified hand held photopolymerizer (Ultralux ?, Dabi Atlante, Ribeir?o Preto , S?o Paulo, Brazil.). Planktonic cultures were prepared and submitted to different experimental conditions: 1. PDT using TB 2. PDT using MB, 3. L+ FS- , 4. TB + L - ; 5. MB+ L-; 6. L- FS- (negative control) and 7. administration of 0.12% chlorhexidine digluconate (positive control) (Periogard ?, Colgate-Palmolive Company, New York, USA). The immediate and mediated action of PDT on bacterial suspensions, as well as its effect on biofilm formation were observed from the number of colony-forming units per milliliter (CFU/mL) and measures optical density (OD). The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test for the significance level of 5%. According to the results, the PDT showed no antibacterial action on suspensions of S. mutans, regardless of the dye used. PDT with MB activated by halogen light was able to reduce 86.6% CFU/mL multi-species planktonic cultures, however, this reduction was not significant (p > 0.05). PDT showed antibacterial effect, mediate on multi-species planktonic cultures with TB (p < 0.001) and MB (p < 0.001), activated by halogen light. PDT was able to prevent the formation of multispecies biofilm, through the activation of TB by halogen light (p = 0.01). We conclude that activation of the dye toluidine blue and methylene blue, by halogen light (PDT) showed antimicrobial activity, compared to multi-species planktonic cultures prepared from saliva samples / A terapia fotodin?mica (TFD) tem sido proposta como um m?todo alternativo para o tratamento de doen?as orais biofilme-dependentes, como a c?rie dent?ria. Tal terapia consiste na a??o simult?nea de uma fonte luminosa (FL) e de um agente fotossensibilizante (FS), na presen?a de oxig?nio tecidual, levando ? produ??o de radicais livres que ao interagirem com componentes celulares bacterianos, promovem a morte celular. Este estudo tem como objetivo avaliar a a??o antimicrobiana da TFD sobre bact?rias orais em suspens?o, bem como na forma??o de biofilmes mono e multiesp?cies, in vitro, a partir de uma cepa padr?o de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente. Os corantes azul de metileno (CM) e azul de toluidina (CT) foram administrados na concentra??o de 100 mg/L e ativados por luz hal?gena (600 a 750 nm) proveniente de um aparelho fotopolimerizador modificado (Ultralux?, Dabi Atlante, Ribeir?o Preto, S?o Paulo, Brasil.). Suspens?es monoesp?cies e mistas foram preparadas e submetidas a diferentes condi??es experimentais: 1. TFD na presen?a de CT; 2. TFD na presen?a de CM; 3. irradia??o sem administra??o de qualquer corante; 4. sensibiliza??o com CT e aus?ncia de luz; 5. sensibiliza??o com CM e aus?ncia de luz; 6. aus?ncia de irradia??o e sem qualquer corante (controle negativo) e 7. administra??o de solu??o de digluconato de clorexidina a 0,12% (controle positivo) (Periogard?, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA). A a??o imediata e mediata da TFD sobre as suspens?es bacterianas, bem como seu efeito sobre a forma??o de biofilme foram verificados, a partir do n?mero de unidade formadoras de col?nias por mL (UFC/mL) e de medidas de densidade ?tica (DO). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente atrav?s dos Testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, para o n?vel de signific?ncia de 5%. De acordo com os resultados, a TFD n?o apresentou a??o antibacteriana sobre as suspens?es de S. mutans, independente do corante utilizado. A TFD com CM ativado por luz hal?gena foi capaz de reduzir em 86,6% o n?mero de UFC/mL diante de suspens?es multiesp?cies, entretanto, tal redu??o n?o foi significativa (p > 0,05). A TFD apresentou efeito antibacteriano, mediato, sobre suspens?es mistas, quer na presen?a de CT (p < 0,001) ou CM (p < 0,001), ativados por luz hal?gena. A TFD preveniu a forma??o de biofilme multiesp?cie, atrav?s da ativa??o de CT por luz hal?gena (p = 0,01). Conclui-se que a ativa??o dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, pela luz hal?gena (TFD) apresentou a??o antimicrobiana, frente a suspens?es multiesp?cies preparadas a partir de amostras de saliva, ressaltando a possibilidade da utiliza??o da terapia fotodin?mica como um m?todo coadjuvante no tratamento de les?es de c?rie dent?ria

O aumento significativo de micoses decorrentes do crescimento do número de indivíduos imunocomprometidos, da emergência de novas espécies de fungos patogênicos e do surgimento de patógenos resistentes aos antifúngicos atualmente utilizados é um sério problema de saúde pública. Nesse contexto, é extremamente desejável o desenvolvimento de novas técnicas para o controle de fungos. A TFD (terapia fotodinâmica), inicialmente desenvolvida como uma alternativa terapêutica para o câncer, é um processo que envolve a administração de um fotossensibilizador que se acumula preferencialmente nas células-alvo e que pode ser ativado por exposições à luz. A ativação do fotossensibilizador leva à formação de espécies reativas de oxigênio que são capazes de danificar lipídios, proteínas e ácidos nucléicos, provocando a morte da célula. A TFDA (terapia fotodinâmica antimicrobiana) pode ser utilizada tanto para o controle de micoses localizadas como para a eliminação de espécies patogênicas de fungos do ambiente. Neste estudo, foi avaliada a atividade fotossensibilizadora e foram testados parâmetros funcionais como concentração do fotossensibilizador (1 a 400 g mL-1); tempo de pré-incubação com o fotossensibilizador (0 a 60 min.); doses (90 e 180 kJ m-2) e intensidade de luz visível (50 W m-2) para a fotossensibilização de: (1) fotossensibilizadores comerciais atualmente utilizados na TFDA, como o azul de metileno (MB) e o azul de ortotoluidina (TBO), e (2) complexos nitrosilos de rutênio. Os experimentos foram conduzidos com conídios dos fungos-modelo Metarhizium anisopliae e Aspergillus nidulans. Tanto o MB como o TBO, na presença da luz, foram capazes de inativar os conídios das duas espécies de fungos. A inativação foi próxima de 100%, para ambas as espécies, quando a combinação apropriada (concentração do fotossensibilizador e tempo de exposição à luz) foi utilizada. Nenhum dos dois corantes, na ausência da luz, inativou os conídios das duas espécies. O tempo de pré-incubação com os fotossensibilizadores (MB e TBO) não foi um parâmetro determinante para a eficiência da fotoinativação dos conídios. De maneira geral, a inativação dos conídios foi maior nas fotossensibilizações com MB e TBO por 60 min do que nas por 30 min. Os conídios verdes e amarelos foram mais tolerantes à fotossensibilização com MB e TBO do que os conídios brancos e violetas, indicando que a pigmentação dos conídios influencia na fotoinativação. O nitrosilo de rutênio [Ru(NH.NHq)(tpy)NO](PF6)3 não foi capaz de inativar os conídios de nenhuma das espécies, em nenhuma das condições avaliadas. A fotoinativação dos conídios de M. anisopliae com MB e TBO não ocorreu quando a fotossensibilização foi conduzida em meio de cultura líquido PDB. / The significative increase of mycoses resulting from the growing number of immunocompromised individuals, from the emerging of new species of pathogenic fungi, and from the emerging of pathogens resistant to the antimycotics used nowadays is a serious public health problem. In such scenario, the development of new fungal control techniques is highly desirable. Initially developed as a therapeutical alternative for cancer, PDT (photodynamic therapy) is a process that involves the use of a photosensitizer that preferrably accumulates in the target-cells and that can be light-activated. The activation of the photosensitizer leads to the generation of reactive oxygen species that damage lypids, proteins, and DNA, and kills the cell. APDT (antimicrobial photodynamic therapy) can be used to control localized infections as well as to kill pathogenic fungi in the environment. In this study, we evaluated the photoinactivation by MB (methylene blue), TBO (toluidine blue), and nitrosyl ruthenium complexes in Metarhizium anisopliae and Aspergillus nidulans conidia. We also tested parameters such as photosensitizer concentration (1 to 400 g mL-1), pré-incubation time with the photosensitizer (0 to 60 min.), light doses (90 and 180 kJ m-2), and visible light irradiance (50 W m-2). Both MB and TBO photoinactivated the conidia of the two species of fungi. Inactivation was close to 100% for both species when the appropriate combination between photosensitizer concentration and light exposure time was used. None of the two dyes in the dark inactivated the conidia of the two species. Pre-incubation time with the photosensitizers (MB and TBO) was not a determinant parameter for photoinactivation efficiency. Conidia inactivation was higher in photosensibilizations with MB and TBO for 60 min than in those for 30 min. Green and yellow conidia were more tolerant to photosensibilization than mutants with white and violet conidia, indicating that conidia pigmentation influences photosensibilization. Nitrosyl ruthenium [Ru(NH.NHq)(tpy)NO](PF6)3 was not capable to photoinactivate conidia of any of the species, in any of the evaluated conditions. M. anisopliae conidia photoinactivation with MB and TBO did not occur when photosensibilization was conducted in PDB media.

Diabetic ketoacidosis (DKA) is a life-threatening condition that can appear in patients with diabetes. High ketones in the blood lead to acidity of the blood. For DKA diagnosis and management, ketones such as hydroxybutyrate (HB) can be used to quantify the severity of the disease. The fabrication of electrochemical biosensors for the detection of HB is attractive since their capability to deliver fast response, high sensitivity, good selectivity and potential for miniaturisation. In this thesis, an integrated electrode system was prepared for the detection of HB. Laser-induced graphene (LIG) with a 3D porous structure was used as the flexible platform. Poly (toluidine blue O) (PTB) was electro-deposited on LIG (PTB/LIG) under the optimised conduction (pH of 9.7 and from 0.4 to an upper cyclic potential of 0.8 V). The single PTB/LIG working electrode demonstrated excellent performance towards the detection of NADH with a linear range of 6.7 M to 3 mM using chronoamperometry, high sensitivity of detecting NADH and excellent anti-fouling ability (94 % response current retained after 1500 s). Further integration of the 3-electrode system realised the static amperometric detection of NADH over the range of 78 M to 10 mM. Based on the excellent performance of PTB/LIG to NADH sensing, hydroxybutyrate dehydrogenase was immobilised via encapsulation with chitosan and polyvinyl butyral (PVB) which was used for HB biosensing over the linear range of 0.5 M to 1 mM with NAD+ dissolved in solution. In addition, the co-immobilisation of NAD+ and HBD on PTB/LIG was conducted by optimisation of enzyme and NAD+ amount per electrode, which shows excellent reproducibility and satisfactory HB biosensing performance. Further experiments to improve the long-term stability of the enzyme electrode is expected in the future. The proposed integrated electrode system also possesses the potential to extend to a multichannel sensor array for the detection of multiple biomarkers (e.g. pH and glucose) for diagnosis and management of DKA.