Die kombinierte Mikroperfusions-/Ladungspulstechnik an einzelligen marinen Riesenalgen ermöglicht die getrennte Darstellung der elektrischen Eigenschaften von Plasmalemma und Tonoplast durch gezielte Manipulation des vakuolären und externen Mediums. Dabei kann der für die Physiologie der Zellen wichtige hydrostatische Innendruck (Turgor) ständig kontrolliert werden. Die Applikation eines Ladungspulses resultierte bei Valonia utricularis und Ventricaria ventricosa in einer biphasischen Relaxation des Gesamt-membranpotentials, die durch die Summe zweier Exponentialfunktionen beschrieben werden konnte. Die Zeitkonstanten dieser beiden Relaxationen lagen dabei im Bereich von 0.1 ms und 1 ms (V. utricularis), bzw. 0.1 ms und 10 ms (V. ventricosa). Addition von Nystatin (einem membranimpermeablen und porenbildenden Antibiotikum) zu der vakuolären Perfusionslösung führte bei beiden Spezies zu einem Verschwinden der langsamen Relaxation des Spektrums, während über das Badmedium (extern) dotiertes Nystatin die Zeitkonstante der schnellen Komponente dramatisch verringerte. Die jeweils andere Relaxation blieb dabei unbeeinflusst. Folglich muss die schnelle Relaxation den RC-Eigenschaften des Plasmalemmas und die langsame den Eigenschaften des Tonoplasten zugeordnet werden. Dies ist ein klarer Beweis für das sog. "Zwei-Membranen Modell". In Übereinstimmung damit beeinflussten externe Ionentauschexperimente sowie externe Zugabe von Kanal/Carrier-Inhibitoren wie TEA (Tetraethylammonium), Ba2+ und DIDS (4,4'-Diisothiocyanatostilben-2,2'-Disulfonsäure), nur die schnelle Relaxation des Ladungspulsspektrums, nicht aber die langsame. Dagegen hatte die Zugabe dieser Inhibitoren zu der vakuolären Perfusionslösung keinen signifikanten Einfluss auf das Relaxationspektrum der marinen Algen. Bei der Berechnung der passiven Membranparameter fiel eine ungewöhnlich hohe flächenspezifische Kapazität des Tonoplasten auf, die nach elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit einer etwa 9-fachen Oberflächenvergrößerung erklärt werden konnte. Diese resultierte aus tubulären Ausstülpungen des Tonoplasten, die in das Zytosol hineinreichen. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass - entgegen der Lehrmeinung - der Widerstand des Tonoplasten mariner Algen hoch ist (0.3 bis 1.1 Ohm m²) und somit Werte aufweist, die mit Messungen an Vakuolen höherer Pflanzen vergleichbar sind. Darüber hinaus ergaben Nystatin-Experimente, dass das Zytoplasma von V. ventricosa stark negativ geladen ist (bis zu -70 mV). Neben vielen Gemeinsamkeiten existieren auch klare Unterschiede in der Physiologie dieser Algen. Während bei V. ventricosa die Plasmalemmaleitfähigkeit durch Kalium dominiert wurde, war das Plasmalemma von V. utricularis deutlich permeabler für Chlorid als für Kalium. Variation des externen pH-Wertes wirkte sich nur bei V. utricularis, nicht aber bei V. ventricosa, im Relaxationsspektrum in einer drastischen Erhöhung der schnellen Zeitkonstante aus. Für die Analyse turgorgesteuerter Membrantransportprozesse an marinen Algen bedeuten diese Arbeiten einen methodischen Durchbruch, so dass die vollständige Aufklärung der biophysikalischen Prozesse, die mit der Turgorregulation assoziiert werden, unmittelbar bevorsteht. / The intergrated perfusion/charge-pulse technique allows the separated determination of the electrical properties of the tonoplast and the plasmalemma of giant-celled marine algae with exact manipulation of the vacuolar and external solution. The hydrostatic pressure in the cells (the so-called turgor-pressure), which is one of the most important parameters for the physiology of the cell, can easily be regulated during the experiments. The charge-pulse relaxation spectrum of Valonia utricularis and Ventricaria ventricosa showed a biphasic shape that could be described by the sum of two exponentials decays. The time constants of the two relaxations were calculated to be around 0.1 ms and 1 ms (V. utricularis), and 0.1 ms and 10 ms (V. ventricosa), respectively. Addition of nystatin (a membrane-impermeable and pore-forming antibiotic) to the the vacuolar perfusion-solution of both species resulted in the disappearance of the slow exponential of the spectrum, wheras the presence of nystatin in the bath decreased dramatically the time constant of the fast component. The other relaxation remained unaffected. Consequently, the fast relaxation process must be assigned to the RC-properties of the plasmalemma and the slow one to those of the tonoplast. This is a clear proof for the so-called "two-membrane model". Consistent with this, external variation of the major ions as well as external addition of channel/carrier inhibitors like TEA (tetraethyammonium), Ba2+ and DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid) affected only the fast relaxation, but not the slow one. In contrast, addition of these blockers to the vacuolar perfusion solution showed no measurable effect on the charge-pulse relaxation spectrum of the marine algae. Calculating the individual passive electrical parameters of the membranes, an unusually high area-specific capacitance of the tonoplast was detected. According to electronmicroscopic studies this could be explained by a approximately 9-fold enlargement of the tonoplast surface showing tubular "fingers" invading the cytoplasm. Above that it could be demonstrated that the area-specific resistance of the tonoplast of V. utricularis and V. ventricosa is high (0.3 to 1.1 ohm m²) and thus comparable with data observed on vacuoles of higher plants. Furthermore, the nystatin-studies indicated that the cytoplasm is negatively charged (up to -70 mV). Although they have a lot in common, the two species exhibit some clear differences in their physiology. With V. ventricosa, the conductance of the plasmalemma was dominated by K+, whereas the plasmalemma of V. utricularis was more permeable to Cl- than to K+. Variation of the external pH had a significant effect on the charge-pulse relaxation spectrum only of V. utricularis but not of V. ventricosa. The presented studies can be seen as a technical breakthrough in the analysis of turgor-regulated transport processes of marine algae. A complete elucidation of the biophysical properties which contribute to the turgorregulation can now be achieved.

In a very simplified view, the plant leaf growth can be reduced to two processes, cell division and cell expansion, accompanied by expansion of their surrounding cell walls. The vacuole, as being the largest compartment of the plant cell, plays a major role in controlling the water balance of the plant. This is achieved by regulating the osmotic pressure, through import and export of solutes over the vacuolar membrane (the tonoplast) and by controlling the water channels, the aquaporins. Together with the control of cell wall relaxation, vacuolar osmotic pressure regulation is thought to play an important role in cell expansion, directly by providing cell volume and indirectly by providing ion and pH homestasis for the cytosoplasm. In this thesis the role of tonoplast protein coding genes in cell expansion in the model plant Arabidopsis thaliana is studied and genes which play a putative role in growth are identified. Since there is, to date, no clearly identified protein localization signal for the tonoplast, there is no possibility to perform genome-wide prediction of proteins localized to this compartment. Thus, a series of recent proteomic studies of the tonoplast were used to compile a list of cross-membrane tonoplast protein coding genes (117 genes), and other growth-related genes from notably the growth regulating factor (GRF) and expansin families were included (26 genes). For these genes a platform for high-throughput reverse transcription quantitative real time polymerase chain reaction (RT-qPCR) was developed by selecting specific primer pairs. To this end, a software tool (called QuantPrime, see http://www.quantprime.de) was developed that automatically designs such primers and tests their specificity in silico against whole transcriptomes and genomes, to avoid cross-hybridizations causing unspecific amplification. The RT-qPCR platform was used in an expression study in order to identify candidate growth related genes. Here, a growth-associative spatio-temporal leaf sampling strategy was used, targeting growing regions at high expansion developmental stages and comparing them to samples taken from non-expanding regions or stages of low expansion. Candidate growth related genes were identified after applying a template-based scoring analysis on the expression data, ranking the genes according to their association with leaf expansion. To analyze the functional involvement of these genes in leaf growth on a macroscopic scale, knockout mutants of the candidate growth related genes were screened for growth phenotypes. To this end, a system for non-invasive automated leaf growth phenotyping was established, based on a commercially available image capture and analysis system. A software package was developed for detailed developmental stage annotation of the images captured with the system, and an analysis pipeline was constructed for automated data pre-processing and statistical testing, including modeling and graph generation, for various growth-related phenotypes. Using this system, 24 knockout mutant lines were analyzed, and significant growth phenotypes were found for five different genes. / Sehr vereinfacht gesagt kann Blattwachstum auf zwei Prozesse reduziert werden, Zellteilung und Zellexpansion, gefolgt von Zellwandexpansion. Die Vakuole, das größte Organell der Zelle, übt durch die Kontrolle des Wasserhaushaltes der Pflanze eine wichtige Funktion im Zusammenhang mit der Zellexpansion aus. Dies geschieht durch die Regulierung des osmotischen Druckes, durch Import und Export von organischen und anorganischen Ionen über die Vakuolenmembran (den Tonoplast) und durch die Kontrolle ihrer Wasserkanäle (der Aquaporine). Es wird angenommen, dass die Regulierung des vakuolären osmotischen Druckes eine große Rolle bei der Zellexpansion spielt, da der osmotische Druck die Stärke der mechanischen Kraft des Tonoplast auf die Plasmamembran und die Zellwand bestimmt. In dieser Dissertation wird die Rolle von Tonoplastproteinen und ihrer Gene auf die Zellexpansion anhand der Modellpflanze Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand) untersucht, und Kandidaten für wachstumsrelevante Gene werden identifiziert. Da bisher noch kein Signal für die Lokalisierung von Proteinen im Tonoplast identifiziert wurde, gibt es keine Möglichkeit, genomweite Voraussagen über solche Proteinlokalisierungen zu machen. Daher haben wir eine Reihe von aktuellen Proteom-Studien genutzt, um eine Liste von 117 Genen, die für transmembrane tonoplastproteinkodierende Gene kodieren, zusammenzustellen. Zusätzlich wurden andere wachstumsrelevante Gene und Zellzyklus-Gene in die Liste aufgenommen (38 Gene). Die Expression der Gene während der Blattentwicklung sollte mittels einer sensitiven Technik, der quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR), untersucht werden. Um rasch die für dieses Verfahren notwendigen Oligonukleotide zu entwerfen, wurde ein Computerprogramm („QuantPrime“) entwickelt. Das Programm entwirft automatisch solche Oligonukleotide und überprüft deren Spezifizität in silico auf Ebene der Transkriptome und Genome um Kreuz-Hybridisierungen zu vermeiden, die zu unspezifischen Amplifikationen führen würden. Die qPCR-Plattform wurde in einer Expressions-Studie eingesetzt, um wachstumsrelevante Gen-Kandidaten zu identifizieren. Um wachstumsaktive und nichtaktive Prozesse vergleichen zu können, wurden Proben von unterschiedlichen Bereichen des Blattes zu unterschiedlichen Wachstumsstadien beprobt. Eine musterbasierte Expressionsdatenanalyse wurde eingesetzt, um die Gene hinischtlich ihrer Assoziation mit der Blattexpansionen in eine Rangordnung zu bringen. Die Gene mit dem höchsten Rang wurden als Kandidaten für weitere Experimente ausgewählt. Um die funktionelle Beteiligung dieser Gene auf einer makroskopischen Ebene zu untersuchen, wurden Knockout-Mutanten für die Gen-Kandidaten hinsichtlich ihres Wachstums analysiert. Zu diesem Zweck wurde ein System für die automatisierte Phänotypisierung des Blattwachstums etabliert. Zum einen wurde ein Programm-Paket für detaillierte Annotation von Wachstumsstadien und zum anderen ein Analyse-Paket für automatisierte Datenvorbereitung und statistische Tests entwickelt. Das Analyse-Paket erlaubt die Modellierung und graphische Darstellung verschiedener wachstumsrelevanter Phänotypen. Mit Hilfe dieses Systems wurden 24 Knockout-Mutanten untersucht und signifikante Phänotypen wurden für fünf verschiedene Gene gefunden.

Universiẗat, Diss., 2000--Würzburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2000.

Stomata are structures in plant epidermis which regulate contact between inner and outer environment of the plant by mediating their stomatal aperture. Many inner and outer signals contribute to the ontogenesis of the stomatal pattern. Guard cells undergo significant change of volume and surface during stomatal movement. This change of surface must be compensated by intracellular trafficking of membrane material because biological membrane has limited elasticity. Most of this trafficking takes place between plasma membrane and endosomal compartments. Complex exocyst is protein complex that ensures proper targeting of secretory vesicles to their destination on the plasma membrane. Function of this complex is essential for many cellular processes that require precise targeting of secretion. Mutation in gene Exo70B1 causes different development of the stomatal pattern. Plants with mutated Exo70B1 differ in stomatal size depending on the cultivation conditions more than wild type plant. Protein EXO70B1 is also directly involved in stomatal dynamics because mutants exo70B1 have retarded stomatal opening in response to light. This direct connection can be observed on the fluorescently labeled protein EXOB1 which significantly changes its localization during stomatal movements. None of these observed phenotypes is...