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Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können. / Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata.

Würzburg, Univ., Diss., 2001. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2000

Die Zahl invasiver Pilzinfektionen ausgelöst durch C. glabrata steigt zunehmend und auch die Ausbildung multipler Resistenzen wird immer häufiger registriert. In dieser Arbeit wurden zwei klinische MDR-C. glabrata-Stämme systematisch analysiert, um den Ursprung der Mehrfachresistenz zu finden. Aufgefallen waren jene Isolate in vorhergehenden Untersuchungen von Aldejohann et. al., die 176 Stämme, die dem Referenzzentrum NRZ-Myk zugesandt wurden, auf ihr Resistenzverhalten gegen Echinocandine analysierten und auf FKS-Mutationen untersuchten. Die Isolate CG22 und CG56 zeigten ein Resistenzverhalten gegen Anidulafungin ohne eine FKS-Mutation aufzuweisen. In Mehrfachtestungen wurde das einheitliche Verhalten von CG56 in zehn Einzelkolonien verifiziert, um Mischkulturen oder heterogenes Verhalten innerhalb des Isolates ausschließen zu können. Nach Analyse der gesamten Genomsequenz von CG56 zeigte sich eine Mutation kurz vor der HS-Region von FKS2, die eine Erklärung für das Resistenzverhalten zu liefern scheint. Neben der Mutation in FKS2 wurde ebenfalls eine Mutation in FKS1 und in ERG3 bestätigt. Die Mutation in ERG3 führt zu einer Verschiebung im Sterolsynthesepathway und zu einer Neuverteilung der Zellmembranbestandteile. Das klinische Isolat CG22 fällt mit Resistenzen gegen Azole, Echinocandine und Amphotericin B auf und zeigte ebenfalls eine Mutationen in ERG3. Zusätzlich dazu ergab sich eine Loss-of- Function-Mutation in ERG4 und damit verbunden einen massiv reduzierten Ergosterolgehalt der Zellmembran. Die seltene Kombination aus ERG3 und ERG4 Mutation scheint die Erklärung für die außergewöhnliche Amphotericin B-Resistenz von CG22 zu liefern und wird hier als erstmals bei einem C. glabrata Isolat beschrieben. Dieser besondere Stamm, der sogar als panresistent bezeichnet werden kann, sollte Bestandteil weiterer Forschung werden. Der Sterolsynthesepathway dient als Angriffspunkt vieler Antimykotika und kann durch seine vielen Intermediate und abweichenden Abläufen zu unterschiedlichen Stoffwechselendprodukten führen. Der Ergosterolgehalt der Zellmembran eines C. glabrata-Stammes kann weitere Rückschlüsse auf die Empfindlichkeit des Isolates geben und somit die Chancen des Therapieerfolges der Antimykotikagabe besser vorhersagen und könnte somit einen vielversprechenden Beitrag zur Behandlung lebensbedrohlicher Candidosen leisten. / The number of invasive fungal infections caused by C. glabrata is increasing and the development of resistance to multiple drug classes is also being recorded more frequently. In this study, two clinical MDR C. glabrata strains were systematically analyzed to find the origin of their Multidrug Resistance. These isolates had attracted attention in previous studies by Aldejohann et. al. who studied 176 strains that have been sent to the NRZ-Myk reference center. The strains have been analyzed for their resistance to echinocandins and have been examined for mutations in FKS1 and FKS2 hotspots. The isolates CG22 and CG56 showed resistance to anidulafungin without showing mutation in the FKS hotspots. In multiple testing, the uniform behavior of CG56 was verified in ten individual colonies in order to exclude mixed cultures or heterogeneous behavior within the isolate. Analysis of the entire genome sequence of CG56 revealed a mutation just upstream of the HS region of FKS2, which appears to provide an explanation for the resistance behavior. In addition to the mutation in FKS2, a mutation in FKS1 and ERG3 was also confirmed. The mutation in ERG3 leads to a shift in the sterol synthesis pathway and to a redistribution of the cell membrane components. The clinical isolate CG22 was found to be resistant to azoles, echinocandins and amphotericin B. CG22 showed a mutation in ERG3 and additionally a loss-of-function mutation in ERG4. This leads to a massively reduced ergosterol content of the cell membrane. The rare combination of ERG3 and ERG4 mutation seems to explain the extraordinary amphotericin B resistance of CG22 and is described for the first time in a C. glabrata isolate. This particular strain, which can even be described as panresistant, should become part of further research. The sterol synthesis pathway serves as a target for many antimycotics and can lead to different metabolic products due to its many intermediates and divergent processes. The ergosterol content of the cell membrane of a C. glabrata strain can provide further information on the susceptibility of the isolate. This could possibly predict the chances of therapeutic success of antimycotic treatment better and could therefore make a promising contribution to the treatment of life-threatening candidiasis.