La survenue de lésions hépatiques représente une cause majeure de retrait des médicaments au cours de leur développement et après leur mise sur le marché. La manifestation la plus fréquente des effets secondaires liés aux médicaments est lacholestase qui résulte d’un blocage de la sécrétion biliaire. Ils peuvent être prévisibles, généralement dépendants de la dose, ou dans certains cas n’être observés que chez un nombre restreint de patients traités, par exemple avec la chlorpromazine (CPZ), un neuroleptique. Il s’agit alors d’une hépatotoxicité idiosyncratique. Notre travail a eu pour but d’induire une cholestase avec ce médicament et d’étudier les mécanismes impliqués, en présence ou non d’un stress inflammatoire en utilisant comme modèle expérimental les cellules hépatiques différenciées HepaRG dérivées d’un cholangio-hépatocarcinome humain. Nous avons tout d’abord validé ce modèle en montrant que les principaux transporteurs d’influx et d’efflux canaliculaires et basolatéraux sont bien localizes dans les domaines membranaires appropriés, et que les canalicules biliaires sont fonctionnels et fermés comme dans les hépatocytes humains cultivés en sandwich, le modèle de référence. Le traitement par CPZ à une concentration élevée (50μM) entraine après 15min la génération d’un stress oxydant associé à une altération du potentiel membranaire mitochondrial et de la distribution péricanaliculaire des microfilaments de F-actine et à une inhibition de l’efflux canaliculaire de l’acide taurocholique. Après 24h, on observe notamment une inhibition de l’expression des deux principaux transporteurs canaliculaires, BSEP et MDR3, du transporter d’influx NTCP et une surexpression du transporteur basolatéral MRP4. Ces effets suggèrent une réponse compensatrice des cellules face à l’accumulation intracellulaire des acides biliaires. L’inflammation est considérée comme un facteur de susceptibilité dans l’hépatotoxicité idiosyncratique. Nous avons recherché si dans un context inflammatoire induit par l’IL-6 et l’IL-1β, les effets cytotoxiques et cholestatiques de CPZ sont aggravés. Après un prétraitement de 24h par les deux cytokines proinflammatoires, les cellules HepaRG, ont été co-exposées à 20μM CPZ pendant 1 à 5 jours. Bien que les cytokines aient induit un stress inflammatoire et inhibé le métabolisme de la CPZ et les transcrits de CYP3A4 et CYP1A2, deux principaux CYPs impliqués dans le métabolisme de ce médicament, la modulation des effets cytotoxiques et cholestatiques de la CPZ observés est restée limitée, y compris après 5 jours. Une cytotoxicité accrue de 20% et une amplification de l’inhibition des transcrits et de l’activité de NTCP ainsi que la dérégulation de l’expression d’autres gènes liés à la cholestase, ont été constatées suite au co-traitement à CPZ et aux cytokines. Au total, nos résultats montrent qu’il est possible d’induire une cholestase in vitro à partir des cellules HepaRG et que la cholestase induite par CPZ a pour origine l’induction d’un stress oxydant. Ils montrent en outre que l’étude de certains facteurs de susceptibilité peut être envisagée. / Drug-induced liver injury is the major cause of drug withdrawal during development and marketing process. The most common manifestation of adverse drug reactions is cholestasis, which results from alteration of bile flow. Adverse drug reactions are usually classified either as dose-dependent and reproducible (intrinsic) or unpredictable (idiosyncratic) occurring only in certain susceptible patients as observed with chlorpromazine (CPZ), a neuroleptic drug. Our work aimed to induce cholestasis with this drug and to study the mechanisms involved in the presence or absence of an inflammatory stress using differentiated HepaRG liver cells derived from a human cholangio-hepatocarcinoma as an experimental model. We firstly validated this cell model by demonstrating that the major canalicular and basolateral influx and efflux transporters are localized to the appropriate membrane domains, and that the bile canaliculi are functional and closed as in sandwichcultured human hepatocytes, the reference model. Treatment with CPZ at a high concentration (50μM) induces, as early as 15min, generation of oxidative stress which is associated with altered mitochondrial membrane potential, disruption of the pericanalicular F-actin cytoskeleton distribution and inhibition of canalicular efflux of taurocholic acid. After 24-hour treatment with CPZ, mRNA expression of the two main canalicular bile transporters, BSEP and MDR3, and of the main influx transporter, NTCP, was decreased. By contrast, expression of MRP4 mRNA, a basolateral transporter, was increased. These latter events likely represent hepatoprotective responses which aim to reduce intrahepatic accumulation of toxic BA. Inflammation is considered as a factor of susceptibility to idiosyncratic hepatotoxicity. We investigated whether in an inflammatory stress induced by IL-6 and IL-1β, cytotoxic and cholestatic effects of CPZ are exacerbated. After a 24 hour pre-treatment by either pro-inflammatory cytokines, HepaRG cells were co-exposed to 20μM CPZ for 1 to 5 days. Although cytokines have induced inflammatory stress and inhibited the metabolism of CPZ and transcripts of CYP3A4 and CYP1A2, two main CYPs involved in the metabolism of this drug, the modulation of cytotoxic and cholestatic effects of CPZ was limited, even after 5 daily treatments. Increased cytotoxicity by 20 %, amplification of NTCP mRNA and activity inhibition and deregulation of the expression of other genes associated with cholestasis, were observed in CPZ- and cytokine-co-treated cells. Altogether, our results show that it is possible to induce in vitro cholestasis using HepaRG cells and that CPZ-induced cholestasis depends on the generation of oxidative stress. They also show that the certain susceptibility factors may be investigated.

Les fumonisines (FBs) sont les principales mycotoxines produites par Fusarium verticillioides et Fusarium proliferatum, qui se retrouvent partout dans le monde dans le maïs et ses produits dérivés. Les doses toxiques et les signes cliniques de toxicité provoqués par les FBs varient dune espèce à lautre. La toxicité des FBs est généralement liée à leur capacité à bloquer le métabolisme des sphingolipides chez les espèces animales, y compris chez les espèces aviaires. De précédentes études ont démontré que les canards présentent une plus grande sensibilité à la toxicité des FBs que les dindes, alors que laccumulation de sphinganine (Sa) dans les tissues est plus importante chez les dindes que chez les canards. Lobjectif de nos travaux était de comprendre les différences de toxicité entre les dindes et les canards los dune exposition aux FBs. Les trois hypothèses suivantes ont été explorées : i) La toxicocinétique de la fumonisine B2 chez les dindes et les canards. ii) La capacité des cellules aviaires à se protéger de limportante accumulation de sphingolipides libres en augmentant leur catabolisme (phosphorylation). iii) Des mécanismes de toxicité des FBs autre que leur altération via le métabolisme des sphingolipides (stress oxydatif et les réponses inflammatoires). Lanalyse des paramètres de toxicocinétique de la fumonisine B2 na pas mis en évidence de différence significative entre les dindes et les canards. Les mesures de la toxicité simultanée de plusieurs FBs chez les dindes et les canards ont confirmé la forte sensibilité des canards. Laccumulation de shingasine-1-phosphate (Sa1P) dans le foie a également été corrélée avec la quantité de Sa mais pas avec les paramètres hépatiques de toxicité. De plus cette étude a mis en évidence que la quantité de Sa dans le foie était fortement dépendante de la teneur en FBs. Cependant les FBs nont eu aucun effet sur les paramètres de stress oxydatif pour les deux espèces. De manière intéressante, les FBs ont eu une légère réponse inflammatoire chez les canards mais pas chez les dindes. Des investigations plus poussées sur les effets des FBs sur le métabolisme des céramides et sur les processus inflammatoires seraient nécessaires pour comprendre les différences de toxicité entre les dindes et les canards exposés aux FBs. / Fumonisins (FBs) are the major mycotoxins produced by Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum, which are found worldwide in maize and maize products. FBs toxic dose and clinical signs of toxicity vary from one species to another. FBs toxicity is commonly linked to their ability on blocking sphingolipids metabolism in all animal species, including avian species. Previous studies have demonstrated that ducks exhibit higher sensitivity to FBs toxicity than turkeys, whereas, the accumulation of sphinganine (Sa) in tissues is more pronounced in turkeys than in ducks. The objectives of our works were to investigate the causes which lead to different toxicity between ducks and turkeys to FBs exposure. The following three hypotheses were investigated: i) Toxicokinetics of fumonisin B2 in ducks and turkeys. ii) Ability of bird cells to protect themselves against high accumulation of free sphingolipids by increasing their catabolism (phosphorylation). iii) Other toxicity mechanisms of FBs rather than their alteration of sphingolipids metabolism (oxidative stress damage and inflammatory responses). The analysis of toxicokinetic parameters of fumonisin B2 did not provide a significant difference between ducks and turkeys. The measurement of simultaneous toxicity of FBs in ducks and turkeys confirmed higher sensibility of ducks. Also the accumulation of Sphingasine-1-Phosphate (Sa1P) in the liver correlated with the amount of Sa but not parameters of hepatic toxicity. Moreover, this study revealed that the amount of Sa in the liver was strongly dependent on the amount of FBs. On the other hand, FBs had no effect on oxidative damages parameters in both species. Interestingly, FBs had mild inflammatory response effect in ducks but not in turkeys. Further investigation on the effects of FBs on ceramide metabolism and inflammatory processes would be necessary to understand the different toxicity between ducks and turkeys to FBs exposure.