C. perfringens é uma bactéria anaeróbia presente no intestino delgado do homem e animais em equilíbrio e, sob a ação de alguns fatores predisponentes como mudança brusca de alimentação ou super alimentação, stress no manejo ou alto parasitismo intestinal, há a proliferação do microrganismo com a consequente produção de potentes toxinas que provocam a morte do animal. Dentre as toxinas principais destaca-se a toxina alfa, importante fator de virulência, produzida por todos os tipos de C. perfringens, sendo os pertencentes ao tipo A os maiores produtores. A fim de caracterizar o microrganismo em suspeitas de enterotoxemia em ruminantes, trabalhamos com 61 amostras de intestino delgado de bovinos e 12 de ovinos como grupo estudo e no grupo controle composto de animais hígidos levados ao abate, 73 amostras de intestino delgado de bovinos e 24 de ovinos. Foram realizados procedimentos de isolamento e tipagem molecular de C. perfringens e quantificação celular, detecção molecular da toxina &beta;2, além de avaliações moleculares qualitativa (PCR convencional) e quantitativa (PCR em tempo real) do gene da toxina alfa dos diferentes isolados. Em 29 amostras do grupo estudo bovino (47,54%) e em 4 (33,33%) do grupo estudo ovino isolou-se o microrganismo, em contrapartida no grupo controle bovino não houve isolamento do bacilo e 5 amostras do grupo controle ovino (20,83%) foram positivas. Houve diferença estatisticamente significante somente entre os grupos de bovinos (p<0,05). Todos os isolados (100%) foram classificados como tipo A, e os resultados das quantificações celulares de C. perfringens revelaram que todos os bovinos controle apresentaram <10 UFC/g de conteúdo enquanto que o grupo estudo apresentou mediana de 104 UFC/g com variações de <10 UFC/g até 108 UFC/g. Nos ovinos, a mediana no grupo controle foi 101 UFC/g assim como no grupo estudo, entretanto com clara separação de valores entre os grupos. Tanto na PCR convencional quanto na PCR em tempo real para detecção do RNAm da toxina alfa foi observado limiar de detecção de 102 cópias de cDNA por reação, porém provavelmente devido aos valores das amostras estarem próximos ao limite da sensibilidade analítica da reação, não foi observada boa reprodutibilidade da última. Já na reação molecular convencional, observou-se a presença de detecção de RNAm da toxina alfa em 60,52% dos isolados o que revela alguma diferença da presença do transcrito entre as culturas, já que nas cepas restantes não foi detectada a presença do RNAm em questão. A pesquisa do gene da toxina &beta;2 revelou sua presença em 54,55% dos isolados de C. perfringens corroborando com a afirmativa de que o gene está amplamente distribuído entre os ruminantes. A metodologia aplicada para avaliação da expressão do gene da toxina alfa nos isolados mostrou que há diferenças dos níveis de transcrição porém não permitiu quantificar esses valores. A tipagem molecular corrobora com outros estudos quanto à importância epidemiológica do tipo A nos quadros de enterotoxemia em ruminantes, e os dados da quantificação celular permite-nos concluir que animais sadios possuem um nível basal de C. perfringens <10 UFC/g de conteúdo que não possibilita o seu isolamento. / C. perfringens is an anaerobe present in small intestine of man and animals in equilibrium, and under some predisposing factors such as sudden feeding change or super feeding, rough management or high intestinal parasitism, the microorganism multiplies with the consequent production of potent toxins that can cause animal death. Amongst the main toxins, alpha toxin is an important virulence factor, that is produced by all C. perfringens types, and those belonging to type A are its higher producer. Aiming to characterize the microorganism in ruminants suspect of enterotoxaemia, we evaluated 61 bovine small intestinal samples and 12 sheep small intestines as the study group, and for the control group composed by higid animals led to slaughterhousing, 73 bovine small intestines and 24 ovine samples. We performed microbiological culture and molecular typing of C. perfringens isolates, cellular quantification, molecular detection of 2 toxin, and qualitative and quantitative molecular evaluations of alpha toxin from different isolates by means of conventional PCR and real time PCR, respectively. In 29 samples from the bovine study group (47.54%) and in 4 (33.33%) from ovine study group the microorganism was isolated, however in the bovine control group there was no isolation success and 5 samples from sheep control group (20.83%) were positive. There was statistically significant difference only between bovine groups (p<0,05). All isolates (100%) were classified as type A, and C. perfringens cellular quantification results showed that every control bovine presented <10 CFU/g of intestinal contents while the study group presented a median of 104 CFU/g with results ranging from <10 CFU/g to 108 CFU/g. In sheep, the median value in the control group was 101 CFU/g as in the study group, but with a clear division of values between the groups. We observed the threshold detection of 102 cDNA copies per reaction in both conventional and real time PCR reactions for alpha toxin mRNA detection, however since the samples quantification values were close to the analytical sensitivity of the test, we could not observe the reproducibility in the last technique. In the conventional PCR reaction, alpha toxin mRNA was detected in 60.52% of the isolates. This result reveals some difference in the transcript presence among the cultures, since we could not detect the presence of the described mRNA in the other isolates. Beta2 toxin gene was detected in 54.55% of C. perfringens isolates corroborating with the affirmative that this gene is widely distributed among ruminants. The methodology presented herein for the evaluation of alpha toxin gene expression showed that there are differences in the transcription levels, however it didnt allow to quantify these values. Molecular typing results agree with other studies regarding the epidemiological importance of type A in the enterotoxaemia processes in ruminants, and the cellular quantification data allow us to conclude that healthy animals show a basal level of C. perfringens <10 CFU/g of intestinal content that doesnt allow its isolation.

C. perfringens é uma bactéria anaeróbia presente no intestino delgado do homem e animais em equilíbrio e, sob a ação de alguns fatores predisponentes como mudança brusca de alimentação ou super alimentação, stress no manejo ou alto parasitismo intestinal, há a proliferação do microrganismo com a consequente produção de potentes toxinas que provocam a morte do animal. Dentre as toxinas principais destaca-se a toxina alfa, importante fator de virulência, produzida por todos os tipos de C. perfringens, sendo os pertencentes ao tipo A os maiores produtores. A fim de caracterizar o microrganismo em suspeitas de enterotoxemia em ruminantes, trabalhamos com 61 amostras de intestino delgado de bovinos e 12 de ovinos como grupo estudo e no grupo controle composto de animais hígidos levados ao abate, 73 amostras de intestino delgado de bovinos e 24 de ovinos. Foram realizados procedimentos de isolamento e tipagem molecular de C. perfringens e quantificação celular, detecção molecular da toxina &beta;2, além de avaliações moleculares qualitativa (PCR convencional) e quantitativa (PCR em tempo real) do gene da toxina alfa dos diferentes isolados. Em 29 amostras do grupo estudo bovino (47,54%) e em 4 (33,33%) do grupo estudo ovino isolou-se o microrganismo, em contrapartida no grupo controle bovino não houve isolamento do bacilo e 5 amostras do grupo controle ovino (20,83%) foram positivas. Houve diferença estatisticamente significante somente entre os grupos de bovinos (p<0,05). Todos os isolados (100%) foram classificados como tipo A, e os resultados das quantificações celulares de C. perfringens revelaram que todos os bovinos controle apresentaram <10 UFC/g de conteúdo enquanto que o grupo estudo apresentou mediana de 104 UFC/g com variações de <10 UFC/g até 108 UFC/g. Nos ovinos, a mediana no grupo controle foi 101 UFC/g assim como no grupo estudo, entretanto com clara separação de valores entre os grupos. Tanto na PCR convencional quanto na PCR em tempo real para detecção do RNAm da toxina alfa foi observado limiar de detecção de 102 cópias de cDNA por reação, porém provavelmente devido aos valores das amostras estarem próximos ao limite da sensibilidade analítica da reação, não foi observada boa reprodutibilidade da última. Já na reação molecular convencional, observou-se a presença de detecção de RNAm da toxina alfa em 60,52% dos isolados o que revela alguma diferença da presença do transcrito entre as culturas, já que nas cepas restantes não foi detectada a presença do RNAm em questão. A pesquisa do gene da toxina &beta;2 revelou sua presença em 54,55% dos isolados de C. perfringens corroborando com a afirmativa de que o gene está amplamente distribuído entre os ruminantes. A metodologia aplicada para avaliação da expressão do gene da toxina alfa nos isolados mostrou que há diferenças dos níveis de transcrição porém não permitiu quantificar esses valores. A tipagem molecular corrobora com outros estudos quanto à importância epidemiológica do tipo A nos quadros de enterotoxemia em ruminantes, e os dados da quantificação celular permite-nos concluir que animais sadios possuem um nível basal de C. perfringens <10 UFC/g de conteúdo que não possibilita o seu isolamento. / C. perfringens is an anaerobe present in small intestine of man and animals in equilibrium, and under some predisposing factors such as sudden feeding change or super feeding, rough management or high intestinal parasitism, the microorganism multiplies with the consequent production of potent toxins that can cause animal death. Amongst the main toxins, alpha toxin is an important virulence factor, that is produced by all C. perfringens types, and those belonging to type A are its higher producer. Aiming to characterize the microorganism in ruminants suspect of enterotoxaemia, we evaluated 61 bovine small intestinal samples and 12 sheep small intestines as the study group, and for the control group composed by higid animals led to slaughterhousing, 73 bovine small intestines and 24 ovine samples. We performed microbiological culture and molecular typing of C. perfringens isolates, cellular quantification, molecular detection of 2 toxin, and qualitative and quantitative molecular evaluations of alpha toxin from different isolates by means of conventional PCR and real time PCR, respectively. In 29 samples from the bovine study group (47.54%) and in 4 (33.33%) from ovine study group the microorganism was isolated, however in the bovine control group there was no isolation success and 5 samples from sheep control group (20.83%) were positive. There was statistically significant difference only between bovine groups (p<0,05). All isolates (100%) were classified as type A, and C. perfringens cellular quantification results showed that every control bovine presented <10 CFU/g of intestinal contents while the study group presented a median of 104 CFU/g with results ranging from <10 CFU/g to 108 CFU/g. In sheep, the median value in the control group was 101 CFU/g as in the study group, but with a clear division of values between the groups. We observed the threshold detection of 102 cDNA copies per reaction in both conventional and real time PCR reactions for alpha toxin mRNA detection, however since the samples quantification values were close to the analytical sensitivity of the test, we could not observe the reproducibility in the last technique. In the conventional PCR reaction, alpha toxin mRNA was detected in 60.52% of the isolates. This result reveals some difference in the transcript presence among the cultures, since we could not detect the presence of the described mRNA in the other isolates. Beta2 toxin gene was detected in 54.55% of C. perfringens isolates corroborating with the affirmative that this gene is widely distributed among ruminants. The methodology presented herein for the evaluation of alpha toxin gene expression showed that there are differences in the transcription levels, however it didnt allow to quantify these values. Molecular typing results agree with other studies regarding the epidemiological importance of type A in the enterotoxaemia processes in ruminants, and the cellular quantification data allow us to conclude that healthy animals show a basal level of C. perfringens <10 CFU/g of intestinal content that doesnt allow its isolation.

O Clostridium perfringens é um microrganismo anaeróbio que está presente no solo e no trato intestinal dos mamíferos. Provoca intoxicação alimentar nos seres humanos, doenças enterotoxêmicas nos animais domésticos e gangrena gasosa em ambos os grupos. O C. perfringens é classificado em cinco tipos (A, B, C, D e E) mediante a produção de quatro toxinas principais (alfa, beta, épsilon e iota). Neste trabalho foi possível padronizar a técnica de PCR para detectar a presença dos genes cpa, cpb e etx a partir de culturas de C. perfringens. A sensibilidade analítica da técnica de PCR a partir de culturas de C. perfringens foi de 2,27 ng/µL para o gene cpa, 22,7 pg/µL para o gene cpb e 22,7 pg/µL para o gene etx. A pesquisa dos genes cpa, cpb e etx partir de 35 amostras de C. perfringens isoladas de bovinos revelou que 16 (45,7%) eram do tipo A; 18 (51,4%) eram do tipo C e 1 (2,9%) era do tipo B. Não foi observada nenhuma amostra do tipo D. A metodologia de PCR revelou-se útil na tipificação de amostras de C. perfringens isoladas de bovinos, contribuindo para o diagnóstico dessa bacteriose neste país, eliminando as dificuldades de tipificação oriundas do alto custo e da indisponibilidade de anti-soros para a tipificação pela reação de soroneutralização e evitando a utilização de animais de laboratório. / Clostridium perfringens is an anaerobic micro-organism that is present in the soil and gastrointestinal tract of mammals. It causes food poisoning in humans, enterotoxemic diseases in domestic animals and gas gangrene in both. C. perfringens is classified into five types (A, B, C, D and E) according to the production of four major toxins (alpha, beta, epsilon and iota). In this trial was possible to standardize the PCR?s technique to detect cpa, cpb and etx genes from cultures of C. perfringens. PCR?s analythical sensibility was 2.27 ng/µL for cpa gene, 22.7 pg/µL for cpb gene and 22.7 pg/µL for etx gene. The research of cpa, cpb and etx genes from 35 samples of C. perfringens isolated from cattle reveals that 16 (45.7%) were classified as type A, 18 (51.4%) as type C and 1 (2.9%) as type B. No sample of type D was observed. PCR?s technique reveals to be usefull to typify samples of C. perfringens isolated from cattle, contributing to diagnose of this bacterial disease in this country and solving typifing problems represented by the high costs of the process and by the lack of antiserum that is required to typify the micro-organism by seroneutralization. PCR?s technique avoid the use of laboratory animals, too.

O Clostridium perfringens é um microrganismo anaeróbio que está presente no solo e no trato intestinal dos mamíferos. Provoca intoxicação alimentar nos seres humanos, doenças enterotoxêmicas nos animais domésticos e gangrena gasosa em ambos os grupos. O C. perfringens é classificado em cinco tipos (A, B, C, D e E) mediante a produção de quatro toxinas principais (alfa, beta, épsilon e iota). Neste trabalho foi possível padronizar a técnica de PCR para detectar a presença dos genes cpa, cpb e etx a partir de culturas de C. perfringens. A sensibilidade analítica da técnica de PCR a partir de culturas de C. perfringens foi de 2,27 ng/µL para o gene cpa, 22,7 pg/µL para o gene cpb e 22,7 pg/µL para o gene etx. A pesquisa dos genes cpa, cpb e etx partir de 35 amostras de C. perfringens isoladas de bovinos revelou que 16 (45,7%) eram do tipo A; 18 (51,4%) eram do tipo C e 1 (2,9%) era do tipo B. Não foi observada nenhuma amostra do tipo D. A metodologia de PCR revelou-se útil na tipificação de amostras de C. perfringens isoladas de bovinos, contribuindo para o diagnóstico dessa bacteriose neste país, eliminando as dificuldades de tipificação oriundas do alto custo e da indisponibilidade de anti-soros para a tipificação pela reação de soroneutralização e evitando a utilização de animais de laboratório. / Clostridium perfringens is an anaerobic micro-organism that is present in the soil and gastrointestinal tract of mammals. It causes food poisoning in humans, enterotoxemic diseases in domestic animals and gas gangrene in both. C. perfringens is classified into five types (A, B, C, D and E) according to the production of four major toxins (alpha, beta, epsilon and iota). In this trial was possible to standardize the PCR?s technique to detect cpa, cpb and etx genes from cultures of C. perfringens. PCR?s analythical sensibility was 2.27 ng/µL for cpa gene, 22.7 pg/µL for cpb gene and 22.7 pg/µL for etx gene. The research of cpa, cpb and etx genes from 35 samples of C. perfringens isolated from cattle reveals that 16 (45.7%) were classified as type A, 18 (51.4%) as type C and 1 (2.9%) as type B. No sample of type D was observed. PCR?s technique reveals to be usefull to typify samples of C. perfringens isolated from cattle, contributing to diagnose of this bacterial disease in this country and solving typifing problems represented by the high costs of the process and by the lack of antiserum that is required to typify the micro-organism by seroneutralization. PCR?s technique avoid the use of laboratory animals, too.