Titre de l'écran-titre (visionné le 20 mars 2023) / La transducine est une protéine G, composée de trois sous-unités (alpha, $G_α$t; bêta, $G_β$t; gamma, $G_γ$t). La liaison entre la rhodopsine et la $G_{αβγ}$t provoque l'échange du GDP pour le GTP au niveau de la sous-unité $G_α$t, résultant en la dissociation entre les sous-unités $G_α$t et $G_{βγ}$t. Ce projet de recherche est centré sur l'étude des sous-unités $G_β$t et $G_γ$t et du complexe formé par ces deux sous-unités ($G_{βγ}$t), afin de déterminer la stabilité de leur structure individuelle ainsi que celle de l'hétérodimère $G_{βγ}$t. La sous-unité $G_γ$t a été surexprimée dans E. coli en fusion avec deux étiquettes de purification et a ensuite été purifiée par chromatographie d'affinité. L'ADN de la sous-unité $G_β$t a été synthétisé commercialement, individuellement et en fusion avec des étiquettes. Des essais de surexpression de la sous-unité $G_β$t ont été faits dans divers types de cellules hôtes. Toutefois, de faibles quantités de la sous-unité $G_β$t ont été obtenues sous une forme soluble, nécessitant l'utilisation du détergent dodécylsulfate de sodium (SDS) pour optimiser sa production. La sous-unité $G_β$t a ensuite été purifiée en utilisant le même protocole que dans le cas de la sous-unité $G_γ$t. Des travaux ont été faits pour reconstituer l'hétérodimère $G_{βγ}$t en procédant au mélange équimolaire de la sous-unité $G_γ$t purifiée et de la protéine de fusion de la $G_β$t purifiée avec ses étiquettes. Des mesures additionnelles de chromatographie d'exclusion de taille et d'immunobuvardage de type western seront nécessaires pour confirmer la formation de l'hétérodimère $G_{βγ}$t. Des segments externes des bâtonnets ont été purifiés à partir d'yeux bovins afin de purifier la forme farnésylée des sous-unités $G_{βγ}$t pour comparer ses propriétés avec celles de l'hétérodimère $G_{βγ}$t reconstitué. Finalement, ces travaux ont permis de mettre au point un protocole afin de surexprimer et de purifier les sous-unités $G_β$t et $G_γ$t ainsi que pour tenter de former l'hétérodimère $G_{βγ}$t, / Transducin is a G protein composed of three subunits (alpha, $G_α$t; beta, $G_β$t; gamma, $G_γ$t). The binding between rhodopsin and $G_{αβγ}$t causes the exchange of GDP for GTP on the $G_α$t subunit, which results in the dissociation between the $G_α$t and the $G_{βγ}$t subunits. This research project focuses on the study of the $G_α$t and the $G_{βγ}$t subunits as well as the complex formed by these two subunits ($G_{βγ}$t), in order to determine the stability of their individual structure as well as that of the $G_{βγ}$t heterodimer. The $G_γ$t subunit was overexpressed in E. coli in fusion with two purification tags. This subunit was then purified by affinity chromatography.The DNA of the $G_β$t subunit has been synthesized commercially, individually as well as in fusion with purification tags. The $G_β$t subunit has been overexpressed using various types of host cells. However, low amounts of the soluble $G_β$t subunit were obtained, which required the use of the detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) to optimize its production. The $G_β$t subunit was purified using the same protocol as that used for the $G_γ$t subunit. Work has been done to reconstitute the $G_{βγ}$t heterodimer by preparing equimolar mixtures of the $G_γ$t subunit and the $G_β$t fusion protein after their purification. Additional measurements of size-exclusion chromatography and western blot will be necessary to confirm the formation of the $G_{βγ}$t heterodimer.Rod outer segments were purified from from bovine eyes to prepare farnesylated $G_{βγ}$t in order to compare its properties with that of reconstituted $G_{βγ}$t heterodimer. Finally, this research work allowed to develop a protocol in order to overexpress and purify the $G_β$t and $G_γ$t subunits as well as to tentatively reconstitute the $G_{βγ}$t heterodimer.

Ce projet de recherche porte sur la sous-unité gamma de la transducine (Gγt), participant à la phototransduction visuelle, plus précisément pour comprendre son mécanisme d'ancrage aux membranes par des interactions favorables de ses résidus et de son acylation de type farnésyle. La Gγt non-acylée a été obtenue en la surexprimant chez E. coli en fusion avec une étiquette de solubilisation/purification et en la purifiant par chromatographie d'affinité. L'identité de la séquence de la Gγt non-acylée a été confirmée par spectrométrie de masse. Afin d'étudier la forme acylée, des essais de surexpression ont été tentés en procédant à une cotransformation de la Gγt en présence de la farnésyle transférase. De plus, trois peptides ont été synthétisés commercialement pour analyser l'influence de chaque hélice alpha de la Gγt sur sa liaison membranaire, chacune comportant l'une des deux hélices : le segment C-terminal non-acylé, le segment C-terminal acylé et le segment N-terminal. Des analyses par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge ont permis de confirmer la structure secondaire native des formes de la Gγt et de caractériser leur dénaturation en fonction de la température et du temps. La liaison membranaire des formes de la Gγt a ensuite été analysée par le modèle des monocouches de Langmuir avec tensiométrie de surface, par spectroscopie infrarouge en présence de vésicules lipidiques et par spectroscopie infrarouge PM-IRRAS avec des monocouches de différents lipides. Finalement, l'analyse des résultats a permis de démontrer la fragilité de la structure de l'hélice alpha en C-terminal de la Gγt en fonction de la température et au cours de sa liaison membranaire ainsi que l'impact majeur de la farnésylation sur les propriétés de liaison membranaire de son segment C-terminal. Certaines questions de recherche ont été répondues et de nouvelles perspectives de recherche se dévoilent. / This research project aimed to study the gamma subunit (Gγt) of transducin, implicated in the visual phototransduction, more precisely the stability of its individual alpha helical segments and its mechanism of membrane binding involving favorable interactions from its residues and its farnesyl group. The non-acylated Gγt was obtained based on its expression in E. coli in fusion with a solubilization/purification tag and its subsequent purification by affinity chromatography. Its analysis by mass spectrometry allowed to confirm the identity of the non-acylated Gγt. The expression of the farnesylated Gγt was attempted. Three peptides were commercially synthesized to perform the analysis of each individual alpha helix of Gγt and to determine their role in its membrane binding. Each peptide segment contained one of the two alpha helices : the C-terminal non-acylated segment, the C-terminal acylated segment and the N-end segment. Circular dichroism and infrared spectroscopy analyses allowed to confirm the secondary structure of each form of Gγt, and their extent of denaturation has been determined as a function of temperature and time. The membrane binding of each form of Gγt was then analyzed using Langmuir monolayers with surface tensiometry, as well as by infrared spectroscopy in the presence of lipid vesicles and by infrared PM-IRRAS spectroscopy with different lipid monolayers. Finally, the results demonstrated the instability of the alpha helix of the C-terminal segment of Gγt as a function of temperature and the high impact of its farnesylation on the strength of its membrane binding. Some of the initially raised questions were answered while some new perspectives of research are presented.