Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont des cellules présentes en très faible proportion (une cellule pour un million de cellules normales) dans la circulation sanguine, et qui jouent un rôle important dans le processus de métastase responsable de la majorité des décès de patients atteints de cancer. La détection du cancer à un stade précoce augmente les chances de survie des patients. Le but de ce travail a été de développer un ensemble de technologies permettant de mieux caractériser et détecter les CTC.Nous avons concentré notre étude sur les cellules ayant un phénotype hybride, entre épithélial et mésenchymal, qui pourraient correspondre à des CTC de plus fort potentiel métastatique compte tenu du rôle joué par la transition épithelio-mésenchymateuse dans ce processus. Nous avons tout d’abord isolé, par immunofluorescence et cytométrie en flux, une lignée cellulaire de cancer (A549, le carcinome de poumon humain) co-exprimant la E- et la N-cadhérine, de sorte qu’elle puisse être utilisée comme modèle de CTC dans le développement de nouvelles techniques de détection. Nous avons en particulier adapté le système de microscopie de fluorescence et d’analyse d'images PathfinderTM à haut-débit de la société Imstar S.A. pour identifier efficacement quelques milliers de cellules A549 mélangées à du sang de patient, après une étape de filtration par la taille. Afin d’améliorer l’identification des cellules hybrides, nous avons évalué la technique de transfert de Förster résolue en temps qui pourrait révéler avec un excellent rapport signal/bruit la présence à la membrane cellulaire d’agrégats compacts de N- et E-cadhérines. Enfin, afin d’augmenter le nombre de biomarqueurs simultanément détectés par immunofluorescence nous avons contribué à la mise au point de nanocristaux semi-conducteurs fluorescents conjugués avec un anticorps dirigé contre une protéine d'intérêt. Au final, nos résultats fournissent un ensemble de technologies qui pourront être utilisées pour améliorer la détection et la caractérisation des CTC. / Circulating tumor cells (CTCs) are rare cells (one in millions of normal cells) in blood circulatory system playing a key role in the process of metastasis, which is responsible for the majority of death of patients with cancer. Detecting cancer at early stage can give patients higher chances of survival. The aim of this work is to develop a set of technologies capable of characterizing and detecting the CTCs. We restricted our study to CTCs with hybrid phenotype, between epithelial and mesenchymal, that could correspond to circulating cells with the highest metastatic potential, considering the relation of the Epithelial to Mesenchymal Transition to cancer. Using immunofluorescence and flow cytometry, we first isolated a cancer cell line (A549, human lung carcinoma) co-expressing E- and N-cadherin, which is further used as a CTC model in the development of new detection techniques. In particular, we showed that the high throughput automated fluorescence microscope and image processing Imstar S.A. PathfinderTM system can recover efficiently a few thousands of A549 cells spiked in a blood sample, after an initial size-filtering step. We also used time-gated Fluorescence Resonant Energy Transfer to investigate the presence of E- and N-cadherin clusters at the cell membrane that could enhance the detection sensitivity of hybrid phenotype. Finally, in view of increasing the number of simultaneous biomarkers detection by immunofluorescence we contributed to the development of fluorescent semiconductor nanocrystals conjugated with antibody directed against the protein of interest. Altogether, our results provide a set of technologies that can be used to improve the detection and characterization of CTCs.

La dysfonction chronique du greffon est la cause majeure d’échec en transplantation rénale, que son mécanisme soit immunologique ou non. Lorsque l’épithélium tubulaire rénal subit des changements phénotypiques épithéliaux (CPE), évocateurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et associés au développement de lésions irréversibles de fibrose interstitielle et d’atrophie tubulaire, l’évolution se fait vers la diminution de la fonction rénale et de la perte du greffon. Nous avons étudié le phénotype de l’épithélium tubulaire rénal par immunohistochimie et par la mesure dans les urines des ARN messagers de la vimentine, CD45, GAPDH et Uroplakine 1a par RT-PCR. Nous avons comparé les greffes avec donneurs cadavériques et celles avec donneurs vivants et nous avons évalué les performances diagnostiques de la RT-PCR dans les urines pour le diagnostic de CPE chez les patients greffés, ayant une biopsie rénale de surveillance à 3 mois et une biopsie sur indication particulière. Nous avons montré que le score de TEM sur la biopsie de surveillance et l’évolution de la fonction rénale sont meilleurs chez les greffés à partir de donneur vivant, comparé à ceux ayant un greffon de donneur cadavérique. La valeur de l’ARNm de la vimentine et CD45 rapportée à l’uroplakine 1a est corrélée avec le score de vimentine en immunomarquage dans les biopsies de surveillance. Ces biomarqueurs pourraient être utilisés comme un outil non invasif pour surveiller la fibrogénèse dans le greffon rénal. Ce test pourrait être utilisé pour le dépistage précoce des pathologies fibrosantes du greffon rénal. Une étude transcriptomique indépendante a été réalisée, confirmant l’intérêt de la normalisation des ARN messagers par l’ARNm de l’uroplakine, et montrant / Chronic graft dysfunction is the major cause for end-stage renal failure after renal transplantation, both through immune and non-immune mechanisms. When the renal tubular epithelium undergoes epithelial phenotypic changes (EPC), reminiscent of epithelial mesenchymal transition (EMT), and associated with interstitial fibrosis and tubular atrophy, the prognosis is poor with a diminution of renal function and graft loss. In this prospective study. We studied the renal epithelial phenotype by immunohistochemistry and measured mRNA in urine of vimentin, CD45, GAPDH and uroplakin 1a by RT-PCR. We compared grafts from living donors and those from deceased donors. We evaluated the diagnostic performance of RT-PCR on urine for the diagnosis of epithelial phenotypic changes in transplant patients, with renal biopsy surveillance at 3 months and a biopsy on particular indication. We have shown that the EMT score on renal biopsy surveillance and the evolution of graft renal function were better in the patients from living donors than in those from cadaveric donors. The value of the mRNA of vimentin and CD45 relative to the uroplakin is correlated with the score in vimentin immunostaining in routine biopsies. These biomarkers could be used as a noninvasive tool to monitor the renal graft fibrogenesis. This test could be used for early detection of fibrotic diseases of the kidney transplant. In an independant study, the transcriptome in urine was analyzed, and it was found that normalization of mRNA with uroplakin mRNA was useful, and that EPC were associated with immune and inflammatory profiles.