Lorsque l'hépatite chronique C a occasionné une cirrhose et que, du fait de ses complications, le pronostic vital est en jeu au terme de quelques mois, la transplantation hépatique (TH) représente l'unique traitement efficace,. Malheureusement, la récidive quasi-systématique de la cirrhose C, après la transplantation hépatique, est la principale barrière à la survie du greffon. De nombreux facteurs ont été associés à la sévérité des récidives, et une implication des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+ (Treg) et de certains immunosuppresseurs a été suggérée. Par ailleurs, le patient transplanté peut également être confronté au problème du rejet aigu d’allogreffe, qui est partiellement contrôlé par les Treg et par une thérapie immunosuppressive rigoureuse. Paradoxalement, plusieurs études ont suggéré que certains immunosuppresseurs sont moins efficaces que d’autres dans la prophylaxie du rejet d’allogreffe et peuvent même être associés à des épisodes de rejet plus fréquents. Il existait donc un besoin urgent d’évaluer le rôle joué par les immunosuppresseurs sur les Treg dans la récidive de la fibrose C et dans le rejet du greffon. Dans un premier temps, nous avons confirmé l’implication des Treg dans la progression de la récidive de l’hépatite C. En effet, les marqueurs associés à cette population sont surexprimés dans le foie et dans le sérum de patients, 1 an et 5 ans après la TH, et ce proportionnellement à la sévérité de la récidive. Dans un deuxième temps, nous avons évalué l’effet d’immunosuppresseurs utilisés après la TH (cyclosporine A (CsA), tacrolimus, rapamycine et mycophénolate mofétif) sur l’activité des Treg. Nous avons ainsi montré que seule la CsA a une action inhibitrice sur l’activité des Treg, et ce, uniquement aux doses thérapeutiques de 20 et 40 ng/mL (doses administrées au long terme, 5 ans après la TH). Cette inhibition de l’activité des Treg par la CsA ne modifie pas leur phénotype (expression protéique ou génique), mais conduit à la sécrétion d’IL-2 et d’IFN-γ par les Treg, cytokines de la voie Th1. Le mécanisme immunosuppresseur de la CsA étant d’inhiber la transcription de l’IL-2, via la voie calcineurine/N-FAT, nous avons tenté d’identifier si elle agissait sur les Treg par cette voie ou par une voie indépendante de la calcineurine. Deux observations ont renforcé l’hypothèse d’un mode d’action calcineurine/N-FAT - indépendant : (i) le fait que le tacrolimus, qui a le même mécanisme immunosuppresseur que la CsA, n’inhibe pas l’activité des Treg et (ii) le fait que NIM811, un analogue de la CsA n’agissant pas sur la voie de la calcineurine, inhibe l’activité des Treg aux mêmes doses que la CsA. Cette hypothèse a par ailleurs été directement confirmée par l’absence de modification du profil de déphosphorylation du facteur de transcription N-FAT, en présence de CsA. Enfin, bien que les corticoïdes soient connus pour préserver l’activité des Treg et induisent leur prolifération in vitro, ils sont incapables de reverser l’effet inhibiteur de la CsA sur les Treg. Nos résultats suggèrent donc qu’une dose thérapeutique de CsA inhiberait l’activité des Treg CD4+CD25+. Les cellules T régulatrices jouent un rôle important dans la tolérance du greffon et dans la sévérité des récidives après la TH, leur inhibition par la CsA pourrait alors favoriser le rejet du greffon et diminuer la sévérité des récidives. Ces résultats sont importants dans la mesure où la transplantation hépatique est à l’heure actuelle la seule alternative de survie au stade du carcinome hépatocellulaire, et qu’il n’existe aucun traitement efficace contre le rejet du greffon ou la récidive de l’hépatite C. Le traitement immunosuppresseur idéal n’existe pas, cependant il ne devrait pas augmenter l’activité suppressive des Treg, au risque de favoriser la récidive de l’hépatite C, ni inhiber cette activité, au risque de favoriser le rejet du greffon. / Liver transplantation (LT) remains the only effective therapeutic approach for cirrhosis related HCC patients. Inevitable hepatitis C virus (HCV) recurrence after liver transplantation is a major barrier to the survival of a transplanted liver. It may be promoted by immunosuppression and the emergence of CD4+CD25+ regulatory T cells (Treg). Transplanted patients are also been confronted to allograft rejection, which is partially controlled by Treg cells and the administration of an immunosuppressive therapy. However, some immunosuppressive drugs have been associated with more frequent graft rejection. In this context, it was important to assess the effect of immunosuppressive drugs on regulatory T cells, both in HCV recurrence and graft rejection. We have first confirmed the implication of Treg cells in hepatitis C recurrence progression. Indeed, regulatory T cells markers are over-expressed, 1 and 5 years after LT, both in the liver and in periphery and proportionally of the recurrence severity. In a second time, we have analysed the effect of immunosuppressive drugs used after LT (cyclosporine A (CsA), tacrolimus, rapamycine and mycophenolate mofetil) on regulatory T cell activity. We have shown that only low concentrations of CsA (20 and 40 ng/mL) inhibit regulatory T cell activity (these doses are used 5 years after LT). It seems that CsA does not affect regulatory T cell phenotype (protein and gene expression) but lead to a secretion of Th1 cytokines in Treg cells : IL-2 and IFN-γ. As CsA, is known to inhibit IL-2 transcription through the calcineurin/N-FAT pathway, we have tried to identify if CsA inhibits Treg cells via this pathway or via a calcineurin -independent pathway. Two observations have confirmed the hypothesis of a calcineurin -independent pathway : (i) tacrolimus, which have the same immunosuppressive mechanism as CsA, could not inhibit Treg activity, and (ii) NIM811, a calcineurin - independent CsA analog, inhibits regulatory T cell activity at the same concentrations than CsA. Moreover, this hypothesis has been directly confirmed by the absence of of modification of the N-FAT dephosphorylation profile. Lastly, corticoids, known to preserve Treg activity, could induce Treg cell proliferation in vitro. However, they could not reverse the inhibitory effect of CsA on Treg cells. Our results suggest that a therapeutical dose of CsA could inhibit CD4+CD25+ regulatory T cell activity. Treg cells play an important role in graft tolerance and hepatitis C recurrence after LT, so their inhibition by CsA could favour graft rejection and decrease recurrence severity. These results are important, as liver transplantation iscurrently the only survival alternative for HCC related patients. The ideal immunosuppressive therapy does not exist, but it would not increase Treg activity, which may promote hepatitis C recurrence, neither abrogate this activity due to the risk of graft rejection.

Les inhibiteurs de la calcineurine (ICN) sont les immunosuppresseurs les plus employés en transplantation d’organe, malgré leur toxicité et leur efficacité imparfaite. Leurs effets présentent une large variabilité intra-et inter-individuelle, qui n’est pas expliquée par les différences de doses, de concentrations ou d’aires sous la courbe des concentrations en fonction du temps, ce qui limite les bénéfices du suivi thérapeutique pharmacologique et montre que d’autres facteurs contribuent à la variabilité de la réponse. Aucun biomarqueur unique actuellement disponible ne présente tous les prérequis idéaux, c'est -à-dire est à la fois non -invasif, fiable, sensible, spécifique, reproductible et disponible rapidement. Afin d’identifier des biomarqueurs pharmacodynamiques très spécifiques de l’inhibition de la calcineurine et reflétant une part importante de la variabilité inter-individuelle, nos travaux avaient pour objectifs d’explorer la pharmacodynamie des ICN, la force et la variabilité du signal le long de l’axe calcineurine, ainsi que les étapes où les sources de variabilité PD interne (génétiques) ou externe sont les plus influentes. Nos principaux résultats dans les PBMC de volontaires sains ex -vivo montrent que : l’inhibition de NFAT1 dans les noyaux de PBMC et celles de l’expression d’IL -2 et CD25 dans différentes sous -populations de lymphocytes T suivent des modèles I/Imax ; plusieurs polymorphismes dans les gènes impliqués dans la PD des ICN contribuent à la variabilité inter-individuelle de ces biomarqueurs. Chez des patients inscrits en liste d’attente de transplantation hépatique, nous avons pu : mesurer les biomarqueurs PD des ICN avant et après stimulation ex-vivo; montrer des relations PG/PK ainsi que PD/PD au sein de l’axe étudié. Chez des patients transplantés hépatique, ceux sous CsA avaient une plus grande variabilité inter-individuelle PD que ceux sous TAC, ainsi que différents types de régulations au sein de l’axe. En résumé, l’expression d’IL -2 et CD25 dans les lymphocytes T CD8+ ainsi que de CD25 dans les cellules T CD4+ pourraient être des biomarqueurs fiables de l’activité des ICN, qui intègrent la plus grande part de la variabilité inter-individuelle. De plus, des cas cliniques suggèrent que l’expression de NFAT1 dans les noyaux des PBMC pourrait aider à anticiper les épisodes d’infection, alors que la diminution des Treg et des niveaux élevés d’expression d’IL -2 dans les T CD8+ pourraient prédire la survenue du rejet cellulaire aigu. / Calcineurin inhibitors (CNI) are the immunosuppressants most employed in solid organ transplantation, despite their toxicity and suboptimal efficacy. Their effects show huge intra and inter-individual variability, not explained by differences in drug doses, concentrations or areas under the concentration -time curve, limiting the benefits of therapeutic drug monitoring and pointing that other factors contribute to response variability. No single biomarker currently available meets all the ideal requirements, i.e. non-invasiveness, reliability, sensitivity, specificity, reproducibility, and short turnaround time. To search for suitable PD biomarkers, i.e., with high specificity for calcineurin inhibition and most affected by inter-individual variability ,our works aimed at exploring the pharmacodynamics(PD) of CNI, the strength and variability of signal translation along the calcineurin pathway, as well as the steps where sources of internal (genetic) or external variability are the most influential .Our main results in healthy volunteers’ PBMC ex vivo showed : that the inhibition of NFAT1 in PBMC nuclei and of IL-2 and CD25 expression in different subsets of T lymphocytes followed I/Imax models; that IL-2 and CD25 responses to NFAT inhibition fitted and allosteric sigmoid model; and that several polymorphisms in genes involved in CNI PD participated in the inter-individual variability of these biomarkers. In patients on the waiting list of liver transplantation we were able: to measure CNI PD biomarkers before as well as after ex-vivo stimulation; to report PG/PD relationships, as well as PD/PD interactions within the pathway. In liver transplant recipients, those on cyclosporine showed more inter -individual PD variability than those on tacrolimus and different regulations within the pathway. In summary, IL-2 and CD25 in CD8+ T cells and CD25 in CD4+ T cells may be reliable biomarkers of CNI activity, with the largest inter-individual variability. Moreover , clinical cases suggest that NFAT1 levels in PBMC nuclei might help to anticipate infection episodes, while Tregs diminution and high levels of IL-2 expression in CD8+ T cells might predict acute cellular rejection.