Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:48Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-08-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) / Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) / Ligue Française Contre l'Épilepsie (LFCE) / Foi mostrado anteriormente que os transportadores de glutamato controlam eficientemente atividade de rede no cérebro imaturo de roedores prevenindo a geração de crises. Em particular, inibição de transportadores de glutamato pelo DL-TBOA produz um padrão patológico no eletroencefalograma de ratos recém nascidos registrados em livre movimento. Esse padrão é composto de crises parciais e de breves surtos paroxísticos recorrentes alternados com períodos silenciosos caracterizados como atividade de “surto-atenuação”. A associação de surto-atenuação e crises parciais é observada em recém nascidos cometidos de encefalopatias epilépticas precoces, levantando a possibilidade que transportadores de glutamato podem estar implicados nesta síndrome epiléptica. Curiosamente, TBOA produz despolarizações recorrentes de longa duração e surtos de potencial de ação em interneurônios e células piramidais em fatias corticais. Esse padrão referido como “Slow Network Oscillations” (SNOs) e as crises observadas em vivo, são bloqueadas por antagonistas de receptores NMDA (APV), sugerindo que ambos compartilham mecanismos similares. Assim SNOs providenciam um modelo in vitro para investigação dos mecanismos envolvidos na gênese de atividades paroxísticas. Utilizando registros eletrofisiológicos, nós mostramos que SNOs refletem dois processos que ocorrem durante a inibição de transportadores de glutamato: (1) Um aumento local da concentração de glutamato que ativa ambos receptores NMDA e metabotrópicos (mGluRs) de glutamato de maneira tônica. A ativação de mGluRs reduz a corrente de potássio (IM) aumentando a excitabilidade neuronal. (2) Uma liberação fásica de glutamato que escapa da fenda sináptica (“spillover”) e ativa receptores NMDA extra-sinápticos localizados em ambos interneurônios e células piramidais. Utilizando microscópio de dois fótons multi-feixe, nós analisamos a dinâmica de cálcio das SNOs e mostramos que elas são associadas com ondas recorrentes de cálcio. As ondas de cálcio SNOs não se originam em locais específicos e se propagam lentamente de maneira unidirecional ativando toda a rede neuronal. Assim, propomos que a redução tônica de IM torna a rede neuronal propensa à geração de crises. As atividades paroxísticas são geradas uma vez que os neurônios são suficientemente despolarizados atingindo um potencial de membrana onde IM é normalmente ativada. Nossos resultados indicam que essa despolarização ocorre devido à ativação de receptores extra-sinápticos NMDA. De maneira geral, nossos experimentos revelam que receptores mGluRs e NMDA trabalham em sinergia desempenhando um papel importante na geração de crises. Nós especulamos que esta sinergia acontece em patologias neuronais associadas com a perda de homeostase de glutamato como, por exemplo, em insultos anóxo-isquêmicos / It has been previously shown that cell-surface glutamate transporters efficiently control network activity in the maturing rodent brain, preventing the generation of seizures. In particular, inhibition of glutamate transporters by DL-TBOA leads to a pathological EEG pattern in freely moving rat pups. This is composed of partial seizures and recurrent short paroxysmal bursts, alternating with silent periods, and is characteristic of “suppression burst” activity (SB). The association of SB and partial seizures is observed in neonates suffering from early epileptic encephalopathy, raising the possibility that glutamate transporters could be implicated in this syndrome. Interestingly, TBOA produces recurrent long lasting depolarizations and bursts of action potentials in interneurons and pyramidal cells in cortical slices. This pattern referred to as slow network oscillations (SNOs) and the seizures observed in vivo, were blocked by the NMDA receptor antagonist (APV), suggesting that they share similar mechanisms. Therefore, SNOs provide a suitable in vitro model for investigating the mechanisms involved in the genesis of paroxysmal activity. Using electrophysiological recordings we show that SNOs reflect two processes that occur during inhibition of glutamate transporters: (1) An ambient increase in glutamate concentrations, that tonically activates both NMDA receptors and glutamate metabotropic receptors (mGluRs). The activation of mGluRs reduces the potassium current (IM), increasing neuronal excitability. (2) A phasic release of glutamate that spills out of synapses and activates extrasynaptic NMDA receptors located in both interneurons and pyramidal cells. Using multibeam two-photon microscopy, we analyzed SNOs calcium dynamics and show that they are associated with recurrent calcium waves. The SNOs calcium waves do not have specific sites of origin however they slowly propagate in a unidirectional manner, activating the entire network. Together, we propose that the tonic reduction of IM makes the neuronal network prone to the generation of seizures and the paroxysmal activity is generated when neurons are sufficiently depolarized, and reach the membrane potential where IM is normally activated. Our data indicate that this depolarization occurs due to activation of extrasynaptic NMDA receptors. In total our experiments reveal that mGluRs and NMDA receptors work in synergy playing an important role in the generation of seizures. We speculate that this synergy happens in neuronal pathologies associated with an imbalance in glutamate homeostasis such as anoxo-ischemic insults. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações