Orientador: Claudia Marcia Aparecida Carareto / Banca: Marie-Anne Van Sluys / Banca: Elgion Lucio da Silva Loreto / Banca: Ivan de Godoy Maia / Banca: Maria Elisabete Jorge Amaral / Resumo: Elementos de transposição (TEs) são entidades genéticas que podem ter profundos impactos, estrutural, funcional, intra e interespecíficos na evolução dos genomas. A contribuição dos TEs para formação de novas seqüências codificadoras de proteínas é de particular interesse porque sua inserção em exons pode alterar a seqüência protéica influenciando diretamente o fenótipo. Além disso, o estudo das condições que provocam a ativação de TEs, e os mecanismos que os regulam, justifica o interesse de se identificar TEs expressos em tecidos ou condições específicas. Este estudo foca tais questões usando um modelo vegetal: C. arabica, única espécie híbrida e poliplóide do seu gênero, derivada de uma hibridização recente e natural entre C. canephora e C. eugenioides. As análises foram realizadas por meio de uma variedade de abordagens: 1) análises computacionais usando uma combinação de RepeatMasker, tBLASTx e diversas bibliotecas de TEs referência estocadas no Repbase; 2) análises de expressão baseadas em macroarranjos de DNA; e 3) avaliação do número de cópias e distribuição cromossomal de TEs ativos por Hibridização in situ fluorescente (FISH). Foram identificados 180 unigenes com fragmentos de TEs nas três espécies de café. Em uma primeira análise, com base em unigenes selecionados, foi possível sugerir 26 putativas proteínas com inserção de cassetes de TEs, demonstrando uma provável contribuição para a variabilidade do repertório protéico hospedeiro. Por outro lado, 327 ESTs similares a TEs expressos foram identificadas com uma possível abundância diferencial para duas famílias de Ty3/Gypsy (dea1 e Retrosat) identificadas em apenas duas bibliotecas de C. canephora (sementes e pericarpo). Análises de expressão mostraram que muitos dos mRNAs quiméricos e TEs ativos apresentam baixa expressão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Transposable elements (TEs) are genetic entities that can have profound structural, intra, interspecific impacts in evolution of the genomes. The contribution of the TEs in the protein coding region is of particular interest because insertions of TE into exons can alter the protein sequence influencing directly the phenotype. Moreover, the analysis of the conditions that cause the TE activation and the mechanisms that regulate them justify the interest of identifying expressed TEs in tissues or specific conditions. This study focus such subjects using the plant model: C. arabica, unique hybrid species and polyploidy of their genus, derived of a recent and natural hybridization between C. canephora and C. eugenioides. The analyses were performed by a variety of approaches: 1) computational analyses using a combination of RepeatMasker, tBLASTx e several libraries of reference TEs stored in Repbase; 2) expression analysis based in macroarrays; and 3) evaluation of copy number e chromosomal distribution of expressed TEs by Fluorescent in situ hybridization (FISH). 180 unigenes containing TE fragments were identified in the three Coffea species. Based in selected unigenes, it was possible to identify 26 putative proteins harboring TE-cassettes, demonstrating a probable contribution for the host protein repertory variability. In addition, 327 ESTs similar to expressed TEs were identified with a probable differential abundance for two families of Ty3/Gypsy (dea1 and Retrosat) identified only in two cDNA libraries from C. canephora (seeds and pericarp). Our expression analyses showed that most of the chimerical mRNAs and expressed TEs has low or null expression. On the other hand, several transcripts had their expression reestablished in cell culture treated with Cycloheximide, a drug that permit the accumulation of transcripts previously silenced by reverting a mechanisms... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Claudia Marcia Aparecida Carareto / Banca: Ricardo De Marco / Banca: André Luís Laforga Vanzela / Resumo: A resistência aos inseticidas é um modelo de processo evolutivo onde o inseticida atua como agente seletivo e, como resposta à seleção, ocorre a evolução da resistência nas populações de insetos. As enzimas citocromo P450 monooxigenases (CYP) formam uma família responsável pela resistência aos inseticidas. Tem sido proposto que a inserção de elementos transponíveis (TEs) em regiões reguladoras ou codificadoras dos genes da família Cyp pode alterar a expressão gênica e induzir a resistência aos inseticidas. No presente estudo foram realizadas análises in silico que permitiram identificar a ocorrência de inserções de fragmentos de TEs em 35 genes Cyps com diferentes funções, e em seus genes flanqueadores, em Drosophila melanogaster e D. simulans, além de 13 genes Cyps de seis espécies do grupo melanogaster de Drosophila. As inserções de TEs ocorreram principalmente nas regiões flanqueadoras 5' dos Cyps associados à resistência aos inseticidas e à função monooxigenase geral. Os resultados não indicaram qualquer relação entre a distância em relação ao gene e o número de inserções. As análises mostraram que a maioria das inserções pertence à classe de transposons de DNA, sendo o transposon DNAREP1_DM o que apresentou o maior número de cópias. O fato de essas seqüências apresentarem putativos sítios de ligação de fatores de transcrição sugere que possam desempenhar algum papel na regulação dos genes Cyps. Também foi analisada a ocorrência de polimorfismos de inserção de TEs em regiões flanqueadoras de genes da família Cyp, em diferentes linhagens geográficas resistentes e suscetíveis, de D. melanogaster e D. simulans. Análises evidenciaram a presença de polimorfismo interpopulacional de tamanho das regiões flanqueadoras dos genes Cyp6w1, Cyp6a2 e Cyp12d1, porém, não indicaram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Insecticide resistance is a model of evolutionary process where the insecticide acts as the selective agent and resistance in the insect populations evolves as an answer to selection. Cytochrome monooxygenases (CYP) is family of enzymes responsible for the insecticide resistance. It has been proposed that insertion of transposable elements (TEs) in regulatory or coding regions of the Cyp genes can alter gene expression and induce insecticide resistance. In the present study in silico analyses allowed identifying the insertion of TE fragments in 35 Cyp genes with different functions, in Drosophila melanogaster and D. simulans, as well as in 13 Cyps of six species of the melanogaster group of Drosophila. The TE insertions occurred mainly in the 5' flanking regions of Cyp genes associated to resistance and to those with a general monooxygenase function. The results did not indicate any relationship between the number of insertions and the distance in relation to the gene. The analyses showed that most of the insertions belong to the DNA transposon class, being DNAREP1_DM the most numerous. Since this element carry putative biding sites of transcription factors it can be suggested they play same role in gene regulation. The polymorphism of TE insertions in the flanking regions of Cyp6w1, Cyp6a2 and Cyp12d1, genes associated to resistance, found in resistant and as well as in susceptible geographical strains of D. melanogaster and D. simulans, does not indicate any relationship between the presence of TEs in those regions and the insecticide resistance. The results also showed that the insertions of TEs in the proximities of the Cyps associated to resistance is differential among six species of the melanogaster group, not following the genomic proportion of TEs in each species. These results also suggest that TEs inserted in the Cyp flanking regions can carry out an adaptive... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: O gênero Zaprionus tem sido eleito como um bom modelo biológico para estudos genéticocomparativos com as espécies do subgrupo melanogaster do gênero Drosophila, embora seu posicionamento filogenético dentro da família Drosophilidae ainda seja controverso. Na presente Tese foi investigada a presença de 10 elementos de transposição (TEs) em Zaprionus indianus e Drosophila malerkotliana, bem como a distribuição, a atividade transcricional e as relações evolutivas de três retrotransposons (copia, gypsy e micropia) em sete espécies do gênero Zaprionus. Para isso, foram empregadas as técnicas de Dot blot, PCR, RT-PCR e seqüenciamento. As seqüências obtidas foram comparadas às dos respectivos elementos das demais espécies de drosofilídeos disponíveis nas bases de dados genômicas. Os resultados indicam que Z. indianus e D. malerkotliana apresentam em seus genomas todos os TEs de D. melanogaster investigados. O retrotransposon copia foi seqüenciado e está transcricionalmente ativo nas sete espécies do gênero Zaprionus e constitui uma nova subfamília relacionada aos elementos do subgrupo melanogaster, que foi denominada subfamília GBFDouble-gap. Por outro lado, os retrotransposons gypsy e micropia foram identificados nas espécies do subgênero Zaprionus, onde também estão transcricionalmente ativos, e pertencem às subfamílias já descritas para as espécies do subgrupo melanogaster. As análises evolutivas sugeriram que esses três retrotransposons devem ter participado de eventos de transferência horizontal com as espécies do subgrupo melanogaster e com pelo menos um doador desconhecido, no caso do retrotransposon micropia. Além disso, o cálculo dos tempos de divergência dos elementos sugere que eles passaram por ondas de transferências horizontais, mais antigas para o retrotransposon copia, e mais recentes para gypsy e micropia. Esses resultados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Zaprionus genus has been elected as a good biological model for comparative analyses with the melanogaster subgroup of Drosophila genus, though its phylogenetic positioning within the Drosophilidae family is still controversial. This study aiming at investigating the occurrence of 10 transposable elements (TEs) in Zaprionus indianus and Drosophila malerkotliana species, as well the distribution, transcriptional activity and evolutionary relationships of three retrotransposons (copy, gypsy and micropia) in seven species of Zaprionus genus. To do so, Dot blot, PCR, RT-PCR and sequencing methods were employed. The Zaprionus sequences obtained were compared with the drosophilid sequences available in genomic databases. The results indicated that Z. indianus and D. malerkotliana harbor all D. melanogaster TEs investigated. The copia retrotransposon is present and transcriptionally active in seven species of the Zaprionus genus and represents a new subfamily related to that of the melanogaster subgroup, named as GBFDouble-gap subfamily. Additionally, gypsy and micropia retrotransposons were identified in the Zaprionus species subgenus, which are transcriptionally active and belong to the melanogaster subgroup subfamilies. The evolutionary analysis showed the three retrotransposons could have been involved in horizontal transfer events with species of the melanogaster subgroup for the three retrotransposons and at least one unknown donor regarding to micropia retrotransposon. Moreover, the time of divergence seems to indicate that the retrotransposons experienced horizontal transfer waves, the oldest involving the copia element followed by the gypsy and micropia retrotransposons in more recent times. These results suggest that the horizontal transfer phenomenon has happened repeatedly during the Zaprionus genus and melanogaster subgroup evolution in the Afrotropical region. / Orientador: Cláudia Márcia Aparecida Carareto / Coorientador: Marie Anne Van Sluys / Banca: Hermione Elly Melara de Campos Bicudo / Banca: Maria Magdalena Rossi / Banca: Galina Ananina / Banca: Elgion da Silva Loreto / Doutor