Regulatory T cells (Tregs) are a subpopulation of T cells with immuno-suppressive properties. Tregs play a key role in immune response regulation and tolerance to antigens, thereby preventing autoimmunity, and may be partly responsible for the lack of an appropriate immune response against tumor cells. However, a human microRNA (miR) Treg signature has not been described yet. We investigated human natural Tregs and identified a signature composed of five microRNAs (-21, -31, -125a, -181c and -374). Among those, two were considerably under-expressed (miR-31 and miR-125a). We identified a functional target sequence for miR-31 in the 3’ untranslated region (3’ UTR) of FOXP3 mRNA. Using lentiviral transduction of fresh cord blood T cells, we demonstrated that miR-31 and miR-21 had opposite effects on FOXP3 expression. We showed that miR-31 negatively regulates FOXP3 expression by binding directly to its potential target site in the 3’ UTR of FOXP3 mRNA. We next demonstrated that miR-21 acted as a positive, though indirect, regulator of FOXP3 expression. Recent reports have shown that histone deacetylase inhibitors increased FOXP3 expression in T cells. We therefore decided to investigate in non-Treg CD4-positive cells, the mechanisms by which an aspecific opening of the chromatin could lead to an increased FOXP3 expression. We focused on the binding of potentially activating transcription factors to the promoter region of FOXP3 and on modifications in the five miRs constituting the Treg signature. Valproate treatment induced binding of Ets-1 and Ets-2 transcription factors to the FOXP3 promoter and acted positively on its expression, by increasing the acetylation of histone H4 lysines. Valproate treatment also induced the acquisition of the miRs of Treg signature. To elucidate whether the changes in the miRs expression could be due to the increased FOXP3 expression, we transduced these non-Tregs with a FOXP3 lentiviral expression vector, and found no changes in miRs expression. Therefore, the modification in their miR expression profile is not due to an increased expression of FOXP3 but directly results from histone deacetylase inhibition. Rather, the increased FOXP3 expression results from the additive effects of Ets factors binding and the change in the expression level of miR-21 and miR-31. These data, by allowing a better understanding of the molecular phenomena underlying the number and function of Tregs, could open the door to novel therapeutic approaches in cancer immunotherapy and treatment of autoimmune disorders.

Mother-to-child transmission of HIV is the leading cause of pediatric AIDS; however, mechanisms by which HIV compromises pregnancy are not understood. CD4+CD25+ T-regulatory (Treg) cells play a role in pregnancy maintenance. RNA from early and late gestation placentas and fetuses from FIV-infected and control cats were probed for expression of FIV gag and Treg markers CD25, FOXP3, and CTLA4, using real time reverse-transcriptase (RT)-PCR. High rates of vertical transmission and reproductive failure were detected in early and late pregnancy. In control animals, both FOXP3 and CTLA4 expression decreased with gestational stage, indicating a natural decline in Tregs. Expression of FOXP3 and CTLA4 was decreased at early gestation in FIV-infected queens and a trend toward decreased expression of CD25, FOXP3, and CTLA4 in placentas from FIV-infected queens producing non-viable pregnancies was observed as well. Our results suggest that FIV infection may alter placental Treg function and adversely affect pregnancy outcome.

A sepse é uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica decorrente de um processo infeccioso, a qual acarreta alta taxa de mortalidade. Relatos da literatura tem demonstrado que pacientes e animais de experimentação que sobrevivem à sepse desenvolvem quadro de imunossupressão tardia, o qual contribui com a maior sucetibilidade destes a infecções secundárias. Nosso grupo demonstrou que as células T reguladoras (Tregs) participam ativamente do desenvolvimento desta imunossupressão. O Fator de Necrose Tumoral (TNF) é uma citocina pleotrópica responsável por diversas funções durante a resposta inflamatória, apresentando dois receptores responsáveis pelas suas atividades: o TNFR1 e o TNFR2. Foi demonstrando que o TNF exerce um importante papel na atividade de Tregs, induzindo a proliferação, estabilização do fenótipo e aumentando sua atividade imunossupressora, sugerindo que tais atividades sejam atribuidas ao TNFR2. Desta forma, nosso objetivo foi avaliar a participação dos receptores de TNF no desenvolvimento da imunossupressão pós-sepse. Para isso animais WT, TNFR1-/- e TNFR1/2 -/- foram submetidos à sepse grave, induzida por CLP e tratados com um suporte básico (reposição hidríca e antibioticoterapia). Inicialmente avaliamos a participação dos receptores de TNF na fase aguda da sepse. Demonstramos que nesta fase os receptores de TNF, principalmente TNFR1, apresentam um papel prejudicial na migração de neutrófilos, no controle do processo infeccioso e nas lesões de orgãos decorrentes da sepse. Posteriormente, os animais sobreviventes foram infectados com um dose subletal de L. pneumophila i.n 15 dias após a CLP. Avaliamos a participação dos receptores TNF na sucetibilidade à infecção secundária induzida por L. pneumophila em animais sobreviventes à sepse. Observamos que animais TNFR1-/- sobreviventes à sepse são mais suscetíveis, ao passo que animais TNFR1/2-/- sobreviventes à sepse são resitentes à infecção secundária em relação aos animais WT sobreviventes à sepse. Avaliamos então, a expansão de Tregs no baço destes animais sobreviventes à sepse e, observamos que animais TNFR1-/- apresentam aumento da expansão de Tregs, ao passo que os animais TNFR1/2-/- não apresentaram expansão de Tregs comparados ao WT. Observamos também que as Tregs apresentam maior densidade de receptores de TNF do que as células T convencionais e, que durante a sepse ocorre aumento da densidade destes receptores nas Tregs. Sugerimos então que possivelmente o TNFR1 seja um regulador negativo, enquanto o TNFR2 possa assumir um papel na regulação positiva na expansão de Tregs após a sepse, durante o desenvolvimento da imunossupressão. / Sepsis is a systemic inflammatory response syndrome resulting from infectious process, resulting in high mortality rate. It has been shown that septic mice and patients that survived from sepsis develop a late immunosuppression, which contributes to greater susceptibility to these secondary infections. Our group has shown that regulatory T cells (Tregs) actively participate in the development of this immunosuppression. The Tumor Necrosis Factor (TNF) is pleiotropic cytokine responsible for several processes in the inflammatory response. Two receptors are responsible for the various activities of TNF: TNFR1 and TNFR2. It have shown that TNF plays an important role in the activity of Tregs, inducing proliferation, stabilization of phenotype and increasing their immunosuppressive activity. The authors also suggested that these activities are TNFR2-mediated. Thus, our objective was to evaluate the role of TNF receptors in the acute phase of sepsis and also in the development of immunosuppression post-sepsis. For that, TNFR1-/ -, TNFR1/2 -/ - and WT mice were underwent to severe sepsis induced by CLP and treatment with basic support (hydration and antibiotics). Initially we evaluated the participation of TNF receptors in the acute phase of sepsis. We suggest that at this stage the TNF receptor, TNFR1 mainly exert a deleterious role in the migration of neutrophils in control of the infectious process and the tissue damage resulting from sepsis. In addition, the survivors from the septic event were intranasaly infected with L. pneumophila in the 15th day after sepsis induction. We evaluated the participation of these receptors in susceptibility to secondary infection induced by L. pneumophila in survivors from sepsis. Comparing the animals that survived from sepsis, we observed that TNFR1/2-/- , like WT mice, are not susceptible to the secondary infection, while TNFR1-/- survivors are more susceptible to it. We also observed that TNFR1-/ - animals show increased expansion of Tregs in the spleen, different of TNFR1/2-/- mice, that did not show expansion of Tregs compared to WT. We also observed Tregs have a higher density of receptors for TNF than conventional T cells, whereas during sepsis occurs increased expression of this receptor in Tregs. Altogether, the results suggest that TNFR1 is a negative regulator, whereas TNFR2 may play a role in the upregulation during expansion of Tregs, in development of sepsis-induced imunossupression.

A sepse é uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica decorrente de um processo infeccioso, a qual acarreta alta taxa de mortalidade. Relatos da literatura tem demonstrado que pacientes e animais de experimentação que sobrevivem à sepse desenvolvem quadro de imunossupressão tardia, o qual contribui com a maior sucetibilidade destes a infecções secundárias. Nosso grupo demonstrou que as células T reguladoras (Tregs) participam ativamente do desenvolvimento desta imunossupressão. O Fator de Necrose Tumoral (TNF) é uma citocina pleotrópica responsável por diversas funções durante a resposta inflamatória, apresentando dois receptores responsáveis pelas suas atividades: o TNFR1 e o TNFR2. Foi demonstrando que o TNF exerce um importante papel na atividade de Tregs, induzindo a proliferação, estabilização do fenótipo e aumentando sua atividade imunossupressora, sugerindo que tais atividades sejam atribuidas ao TNFR2. Desta forma, nosso objetivo foi avaliar a participação dos receptores de TNF no desenvolvimento da imunossupressão pós-sepse. Para isso animais WT, TNFR1-/- e TNFR1/2 -/- foram submetidos à sepse grave, induzida por CLP e tratados com um suporte básico (reposição hidríca e antibioticoterapia). Inicialmente avaliamos a participação dos receptores de TNF na fase aguda da sepse. Demonstramos que nesta fase os receptores de TNF, principalmente TNFR1, apresentam um papel prejudicial na migração de neutrófilos, no controle do processo infeccioso e nas lesões de orgãos decorrentes da sepse. Posteriormente, os animais sobreviventes foram infectados com um dose subletal de L. pneumophila i.n 15 dias após a CLP. Avaliamos a participação dos receptores TNF na sucetibilidade à infecção secundária induzida por L. pneumophila em animais sobreviventes à sepse. Observamos que animais TNFR1-/- sobreviventes à sepse são mais suscetíveis, ao passo que animais TNFR1/2-/- sobreviventes à sepse são resitentes à infecção secundária em relação aos animais WT sobreviventes à sepse. Avaliamos então, a expansão de Tregs no baço destes animais sobreviventes à sepse e, observamos que animais TNFR1-/- apresentam aumento da expansão de Tregs, ao passo que os animais TNFR1/2-/- não apresentaram expansão de Tregs comparados ao WT. Observamos também que as Tregs apresentam maior densidade de receptores de TNF do que as células T convencionais e, que durante a sepse ocorre aumento da densidade destes receptores nas Tregs. Sugerimos então que possivelmente o TNFR1 seja um regulador negativo, enquanto o TNFR2 possa assumir um papel na regulação positiva na expansão de Tregs após a sepse, durante o desenvolvimento da imunossupressão. / Sepsis is a systemic inflammatory response syndrome resulting from infectious process, resulting in high mortality rate. It has been shown that septic mice and patients that survived from sepsis develop a late immunosuppression, which contributes to greater susceptibility to these secondary infections. Our group has shown that regulatory T cells (Tregs) actively participate in the development of this immunosuppression. The Tumor Necrosis Factor (TNF) is pleiotropic cytokine responsible for several processes in the inflammatory response. Two receptors are responsible for the various activities of TNF: TNFR1 and TNFR2. It have shown that TNF plays an important role in the activity of Tregs, inducing proliferation, stabilization of phenotype and increasing their immunosuppressive activity. The authors also suggested that these activities are TNFR2-mediated. Thus, our objective was to evaluate the role of TNF receptors in the acute phase of sepsis and also in the development of immunosuppression post-sepsis. For that, TNFR1-/ -, TNFR1/2 -/ - and WT mice were underwent to severe sepsis induced by CLP and treatment with basic support (hydration and antibiotics). Initially we evaluated the participation of TNF receptors in the acute phase of sepsis. We suggest that at this stage the TNF receptor, TNFR1 mainly exert a deleterious role in the migration of neutrophils in control of the infectious process and the tissue damage resulting from sepsis. In addition, the survivors from the septic event were intranasaly infected with L. pneumophila in the 15th day after sepsis induction. We evaluated the participation of these receptors in susceptibility to secondary infection induced by L. pneumophila in survivors from sepsis. Comparing the animals that survived from sepsis, we observed that TNFR1/2-/- , like WT mice, are not susceptible to the secondary infection, while TNFR1-/- survivors are more susceptible to it. We also observed that TNFR1-/ - animals show increased expansion of Tregs in the spleen, different of TNFR1/2-/- mice, that did not show expansion of Tregs compared to WT. We also observed Tregs have a higher density of receptors for TNF than conventional T cells, whereas during sepsis occurs increased expression of this receptor in Tregs. Altogether, the results suggest that TNFR1 is a negative regulator, whereas TNFR2 may play a role in the upregulation during expansion of Tregs, in development of sepsis-induced imunossupression.

Regulatorische T-Zellen (Tregs, CD4+CD25hi-Tregs) haben u. a. die Aufgabe, die Immunantwort sowie die Zytokinfreisetzung zu steuern, um die Immuntoleranz gegenüber körpereigenen Antigenen aufrecht zu erhalten. Es wurde beschrieben, dass depressive Patienten eine erniedrigte Konzentration von Tregs aufweisen. Da es Hinweise darauf gibt, dass Zytokine wie Interleukin (IL)-1IL-6 und Interferon (IFN)-eine Rolle in der Pathophysiologie der Depression spielen, und dass sich die Konzentrationen dieser Zytokine während antidepressiver Therapie ändern, untersuchten wir Veränderungen der Produktion von IL-1IL-6 und IFN- und Veränderungen der Konzentration von CD4+CD25hi-Tregs während antidepressiver Therapie. Wir gewannen dazu das Blut von 16 Patienten mit depressiver Störung in der ersten und sechsten Woche nach stationärer Aufnahme, indem wir die Plasmakonzentrationen von IL-1bestimmten. Ferner wurde die Produktion von IL-1, IL-6 und IFN-in einem Vollblut-Assay unter immunologischer Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS) oder Newcastle Disease Virus (NDV) in-vitro gemessen. Die Lymphozyten wurden differenziert und CD4+CD25hi-Tregs mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Der psychopathologische Status wurde mit der Hamilton-Depressionsskala (HAMD-21) erfasst. Der HAMD-21-Score, die IL-1-Plasmakonzentrationen sowie die LPS-induzierte IL1-- und IL-6-Produktion waren nach sechs Wochen antidepressiver Behandlung signifikant gegenüber der Baseline erniedrigt. Dagegen stieg der Anteil der CD4+CD25hi-Tregs unter den Lymphozyten von 2,74% ± 0,88 (Mittelwert ± Standardabweichung) auf 3,54% ± 1,21 signifikant (p = 0,007) an. Es fand sich keine signifikante Änderung der NDV-induzierten IFN--Produktion. Der Anstieg der CD4+CD25hi-Tregs während antidepressiver Therapie könnte mit dem Abfall der Zytokinproduktion und der psychopathologischen Verbesserung der Patienten in einem kausalen Zusammenhang stehen.

Seminario de Título para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / La función supresora de las células T reguladoras (Tregs) puede tener efectos negativos sobre la respuesta inmune antitumoral. Por lo tanto, es de gran importancia estudiar los factores que alteran la eficiencia de su inhibición, de tal forma de poder mejorar las terapias antitumorales. La alta heterogeneidad de las Tregs periféricas es uno de los problemas que deben ser abordados para mejorar y desarrollar nuevas terapias antitumorales. Dentro del subset de Tregs, nuevos marcadores superficiales para la población T reguladora tipo 1 (Tr1) no-clásica han sido reportados recientemente, permitiendo su identificación mediante la expresión de las moléculas CD49b y LAG-3 en su superficie. El efecto terapéutico de la población identificada mediante estos marcadores ya ha sido estudiado en modelos murinos de diabetes y de artritis inducida por colágeno, en los cuales mostraron un efecto protector. Sin embargo, su rol en el contexto tumoral ha sido poco estudiado. Es por esto por lo que buscamos caracterizar a la población Tr1, identificada mediante la expresión de CD49b, en un modelo murino de melanoma. Sorprendentemente, se encontró que su presencia parece estar fuertemente influenciada por el microambiente en el cual se encuentra. Mientras que en los linfonodos drenantes de tumor (TdLNs) este subset compone tan solo el 4% del total de células T CD4+, en el tumor alcanzan un 30% de las células T CD4+. Por otra parte, las Tregs convencionales Foxp3+ (cTregs), componen alrededor de un 15% de los linfocitos que infiltran el tumor (TILs) que expresan CD4, casi la mitad de lo observado para las Tr1. En cuanto a su fenotipo, se observó que, aunque en menores niveles que las cTregs, alrededor del 50% y 30% de las Tr1 expresan Nrp1, en los TdLNs y en el tumor, respectivamente. Esta molécula es un co-receptor de VEGF, y se ha descrito que es esencial para la estabilidad y función del fenotipo supresor de las cTreg y para la progresión tumoral. Además, se observó que las Tr1 muestran un patrón diferencial de expresión de ciertas moléculas reguladoras, comparado con las cTregs: una mayor intensidad mediana de fluorescencia de la ectonucleotidasa CD73 en el tumor, contrario a lo que se observa en los TdLNs, y una menor producción de IL-10 en el tumor. Se encontró además que la capacidad proliferativa de las cTregs es significativamente mayor a la de las Tr1, tanto en el tumor como en los TdLNs. Así, nuestros resultados destacan las posibles diferencias entre los mecanismos de inmunosupresión de los subsets de Tregs, los cuales pueden variar dependiendo del microambiente (TdLNs versus tumor). / T regulatory cells (Tregs) suppressive function can have a detrimental effect on immune responses against tumor cells. Thus, in order to improve actual anti-tumor therapies, it is of great importance to study the factors altering their inhibition efficiency. The high heterogeneity of peripheral Tregs is one of the problems that have to be addressed to enhance and develop novel anti-tumoral therapies. Within the Tregs subsets, new surface markers for the non-classical type 1 regulatory T cells population (Tr1) have been recently reported, allowing their identification through the expression of the CD49b and LAG-3 molecules. Their therapeutic effect has already been studied in murine models of diabetes and collagen-induced-arthritis, in which they displayed a protective effect. Nevertheless, very few studies have focused on investigating their role in the tumoral context. Thus, we sought to investigate the function of the Tr1 cell subset, identified through the expression of CD49b, in a murine melanoma model. Surprisingly, we found that their presence seems to be strongly influenced by the microenvironment they encounter. Whereas in the tumor draining lymph nodes (TdLNs) this subset composes only around 4% of total CD4+ T cells, in the tumor, they compose almost 30% of CD4+ T cells. On the other hand, conventional Fopx3+ Tregs (cTregs) compose around 15% of CD4+ tumor-infiltrating T cells, almost half of the percentage of Tr1 cells. Regarding their phenotype, we observed that, although in lower levels than cTregs, around 50 and 30% of Tr1 cells express Neuropilin-1 (Nrp1), in the TdLNs and in the tumor, respectively. Nrp1 is a VEGF co receptor, which has been described to be essential for the stability and function of cTregs suppressive phenotype and in tumor progression. Even more, we also observed that Tr1 cells show a differential pattern of expression of some regulatory molecules, compared to cTregs: a higher median fluorescence of the ectonucleotidase CD73 in the tumor microenvironment, contrary to what is seen in the TdLNs, and a lower production of IL 10 in the tumor. Furthermore, we found that the proliferative capacity of cTregs is significantly higher to Tr1 cells, both in the tumor and in the TdLNs. Thus, our results further highlight the possible differences between the immunosuppression mechanisms of the Tregs subsets depending on the microenvironment (TdLNs versus tumor site).

The study of regulatory T cells (Tregs) is a relatively new field. Within the past few decades, research on Tregs has greatly deepened scientists’ understanding of the link between the immune system and cancer. The study of melanoma is one such cancer that has benefited greatly from this area of study. Tregs are a subset of CD4+ T cells (TCs) that are either generated in the thymus or in the periphery. The main role of Tregs in normal immune physiology is to suppress immune cells. This is an essential component in the prevention of autoimmunity. In melanoma, however, Tregs prevent components of the immune system from mounting a robust response to cancerous lesions and tumors. Tregs have been observed to infiltrate melanoma tumors due to chemokines and other soluble signaling molecules such as CCL1 and CCL22. Once Tregs accumulate inside melanoma tumors, they generate an immunosuppressive microenvironment in a contact-dependent and contact-independent manner. IL-10 secretion and use of the CTLA-4 pathway were observed to be the most well characterized modes of suppression but other mechanisms are still being discovered. Clinicians can take advantage of new therapeutics to modulate the activity of Tregs. Exogenous administration of antibodies that bind to CTLA-4, PD-1, CCR4 and other receptors and molecules can prevent Treg development and action. Preventing Tregs from carrying out their suppressive function may allow other elements of the immune system, such as CD8+ TCs, to target and destroy melanoma cells. Clinicians can also measure the relative abundance of Tregs or use the ratio of effector TCs (Teff) and Tregs to predict patient outcomes and survival. More research is needed to determine that precise mechanisms of Treg infiltration and accumulation within the tumor and the mode of Treg suppression. This paper finds that there is no standard Treg identification marker. This can lead to aberrant results and failures such as the inability to distinguish Tregs from melanoma cells that also express Treg-like markers or a failure to identify other Treg subtypes. Lack of consensus also extends to the prognostic value of Tregs due, in part, to small sample sizes and the inability to accurately identify Tregs in vivo. Future research must focus on Treg identification, action, and the elucidation of therapeutic mechanisms. These future studies will ensure that clinicians have the correct information to choose the proper melanoma treatment that will target the specific Treg populations found within patients’ melanoma tumors.

Introdução: Artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por uma inflamação crônica das articulações. A estratégia terapêutica mais utilizada na AR consiste no uso de doses baixas de Metotrexato (MTX), um antagonista do folato, que promove a manutenção de altos níveis de adenosina (ADO) extracelular. No entanto, uma parte considerável dos pacientes é refratária ao tratamento com MTX e o mecanismo pelo qual este fenômeno ocorre ainda não é estabelecido. Estudos demonstram que células Tregs expressam em suas superfícies as ectonucleotidases CD39/ENTPD1 e CD73/ecto-5 \'nucleotidase, enzimas que geram ADO através da degradação de ATP. Estes achados, associados ao fato que a ADO possui potente atividade imunomoduladora, sugere que a atividade antiinflamatória do MTX está relacionada com os efeitos das Tregs. Objetivos: Investigar se os mecanismos de refratariedade ao MTX em pacientes com AR podem estar relacionados com uma deficiência na atividade bioquímica e função supressora de células Tregs, focando principalmente na expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73. Pacientes e Métodos: No presente estudo, amostras do sangue periférico de pacientes com AR (n= 89) e doadores saudáveis (n =16) foram coletadas. Por citometria de fluxo, as populações leucocitárias de PBMC foram fenotipadas para a avaliação da expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 nos diferentes tipos celulares. A atividade das ectonucleotidases em células TCD4+ na geração de ADO extracelular foi avaliada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e ensaios colorimétricos de Verde Malaquita. Resultados: Citocinas inflamatórias IL-1 e TNF- presentes no plasma e a frequência de células TCD4+ produtoras de IL-17 e IFN- estavam significativamente aumentadas em pacientes não responsivos ao MTX (UR-MTX; DAS28- 5,87±0,52; média de idade- 54,7 anos) quando comparadas com pacientes responsivos (R-MTX; DAS28- 2,23±0,57; média de idade- 52,6 anos) e indivíduos saudáveis (IS). Na caracterização fenotípica dos leucócitos de PBMC, não houve diferença na porcentagem de linfócitos TCD4+, TCD8+, células B e células dendríticas entre os grupos analisados. No entanto, observamos um aumento significativo na porcentagem de células Tregs (CD4+CD25+ FoxP3+) em pacientes R-MTX. De maneira interessante, enquanto que a porcentagem de células Tregs expressando CD73 não estava alterada, observou-se um aumento da frequência desta população celular expressando CD39 em pacientes R-MTX. Adicionalmente, a ADO extracelular presente no sobrenadante de células Tregs de pacientes UR-MTX estava reduzida quando comparada aos outros grupos, visto que esse grupo de pacientes também apresenta uma expressão reduzida de CD39 na superfície das Tregs. Conclusão: Em conjunto estes resultados demonstram que a refratariedade de pacientes ao MTX é associada com o número e funções das Tregs, especialmente na geração de ADO extracelular. Esses achados podem gerar novas perpectivas em intervenções terapêuticas para tratamento da AR, proporcionando avanços na escolha de drogas rotineiramente utilizadas para tratar a doença. / Introdução: Artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por uma inflamação crônica das articulações. A estratégia terapêutica mais utilizada na AR consiste no uso de doses baixas de Metotrexato (MTX), um antagonista do folato, que promove a manutenção de altos níveis de adenosina (ADO) extracelular. No entanto, uma parte considerável dos pacientes é refratária ao tratamento com MTX e o mecanismo pelo qual este fenômeno ocorre ainda não é estabelecido. Estudos demonstram que células Tregs expressam em suas superfícies as ectonucleotidases CD39/ENTPD1 e CD73/ecto-5 \'nucleotidase, enzimas que geram ADO através da degradação de ATP. Estes achados, associados ao fato que a ADO possui potente atividade imunomoduladora, sugere que a atividade antiinflamatória do MTX está relacionada com os efeitos das Tregs. Objetivos: Investigar se os mecanismos de refratariedade ao MTX em pacientes com AR podem estar relacionados com uma deficiência na atividade bioquímica e função supressora de células Tregs, focando principalmente na expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73. Pacientes e Métodos: No presente estudo, amostras do sangue periférico de pacientes com AR (n= 89) e doadores saudáveis (n =16) foram coletadas. Por citometria de fluxo, as populações leucocitárias de PBMC foram fenotipadas para a avaliação da expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 nos diferentes tipos celulares. A atividade das ectonucleotidases em células TCD4+ na geração de ADO extracelular foi avaliada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e ensaios colorimétricos de Verde Malaquita. Resultados: Citocinas inflamatórias IL-1 e TNF- presentes no plasma e a frequência de células TCD4+ produtoras de IL-17 e IFN- estavam significativamente aumentadas em pacientes não responsivos ao MTX (UR-MTX; DAS28- 5,87±0,52; média de idade- 54,7 anos) quando comparadas com pacientes responsivos (R-MTX; DAS28- 2,23±0,57; média de idade- 52,6 anos) e indivíduos saudáveis (IS). Na caracterização fenotípica dos leucócitos de PBMC, não houve diferença na porcentagem de linfócitos TCD4+, TCD8+, células B e células dendríticas entre os grupos analisados. No entanto, observamos um aumento significativo na porcentagem de células Tregs (CD4+CD25+ FoxP3+) em pacientes R-MTX. De maneira interessante, enquanto que a porcentagem de células Tregs expressando CD73 não estava alterada, observou-se um aumento da frequência desta população celular expressando CD39 em pacientes R-MTX. Adicionalmente, a ADO extracelular presente no sobrenadante de células Tregs de pacientes UR-MTX estava reduzida quando comparada aos outros grupos, visto que esse grupo de pacientes também apresenta uma expressão reduzida de CD39 na superfície das Tregs. Conclusão: Em conjunto estes resultados demonstram que a refratariedade de pacientes ao MTX é associada com o número e funções das Tregs, especialmente na geração de ADO extracelular. Esses achados podem gerar novas perpectivas em intervenções terapêuticas para tratamento da AR, proporcionando avanços na escolha de drogas rotineiramente utilizadas para tratar a doença.

Προσπάθεια να δειχτεί η σχέση μεταξύ των φυσικών και των προσαρμοσμένων Tregs σε άτομα που υποβλήθηκαν σε εγχειρήσεις και να δειχθεί κατά πόσο επηρεαζόταν σε αριθμούς οι πληθυσμοί των κυττάρων αυτών. / It has been made the effort to show the relationship between natural and adaptive Tregs in subjects that have been operated and to show in which way the numbers of these populations where affected.

Introdução: Artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por uma inflamação crônica das articulações. A estratégia terapêutica mais utilizada na AR consiste no uso de doses baixas de Metotrexato (MTX), um antagonista do folato, que promove a manutenção de altos níveis de adenosina (ADO) extracelular. No entanto, uma parte considerável dos pacientes é refratária ao tratamento com MTX e o mecanismo pelo qual este fenômeno ocorre ainda não é estabelecido. Estudos demonstram que células Tregs expressam em suas superfícies as ectonucleotidases CD39/ENTPD1 e CD73/ecto-5 \'nucleotidase, enzimas que geram ADO através da degradação de ATP. Estes achados, associados ao fato que a ADO possui potente atividade imunomoduladora, sugere que a atividade antiinflamatória do MTX está relacionada com os efeitos das Tregs. Objetivos: Investigar se os mecanismos de refratariedade ao MTX em pacientes com AR podem estar relacionados com uma deficiência na atividade bioquímica e função supressora de células Tregs, focando principalmente na expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73. Pacientes e Métodos: No presente estudo, amostras do sangue periférico de pacientes com AR (n= 89) e doadores saudáveis (n =16) foram coletadas. Por citometria de fluxo, as populações leucocitárias de PBMC foram fenotipadas para a avaliação da expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 nos diferentes tipos celulares. A atividade das ectonucleotidases em células TCD4+ na geração de ADO extracelular foi avaliada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e ensaios colorimétricos de Verde Malaquita. Resultados: Citocinas inflamatórias IL-1 e TNF- presentes no plasma e a frequência de células TCD4+ produtoras de IL-17 e IFN- estavam significativamente aumentadas em pacientes não responsivos ao MTX (UR-MTX; DAS28- 5,87±0,52; média de idade- 54,7 anos) quando comparadas com pacientes responsivos (R-MTX; DAS28- 2,23±0,57; média de idade- 52,6 anos) e indivíduos saudáveis (IS). Na caracterização fenotípica dos leucócitos de PBMC, não houve diferença na porcentagem de linfócitos TCD4+, TCD8+, células B e células dendríticas entre os grupos analisados. No entanto, observamos um aumento significativo na porcentagem de células Tregs (CD4+CD25+ FoxP3+) em pacientes R-MTX. De maneira interessante, enquanto que a porcentagem de células Tregs expressando CD73 não estava alterada, observou-se um aumento da frequência desta população celular expressando CD39 em pacientes R-MTX. Adicionalmente, a ADO extracelular presente no sobrenadante de células Tregs de pacientes UR-MTX estava reduzida quando comparada aos outros grupos, visto que esse grupo de pacientes também apresenta uma expressão reduzida de CD39 na superfície das Tregs. Conclusão: Em conjunto estes resultados demonstram que a refratariedade de pacientes ao MTX é associada com o número e funções das Tregs, especialmente na geração de ADO extracelular. Esses achados podem gerar novas perpectivas em intervenções terapêuticas para tratamento da AR, proporcionando avanços na escolha de drogas rotineiramente utilizadas para tratar a doença. / Introdução: Artrite reumatóide (AR) é uma doença autoimune caracterizada por uma inflamação crônica das articulações. A estratégia terapêutica mais utilizada na AR consiste no uso de doses baixas de Metotrexato (MTX), um antagonista do folato, que promove a manutenção de altos níveis de adenosina (ADO) extracelular. No entanto, uma parte considerável dos pacientes é refratária ao tratamento com MTX e o mecanismo pelo qual este fenômeno ocorre ainda não é estabelecido. Estudos demonstram que células Tregs expressam em suas superfícies as ectonucleotidases CD39/ENTPD1 e CD73/ecto-5 \'nucleotidase, enzimas que geram ADO através da degradação de ATP. Estes achados, associados ao fato que a ADO possui potente atividade imunomoduladora, sugere que a atividade antiinflamatória do MTX está relacionada com os efeitos das Tregs. Objetivos: Investigar se os mecanismos de refratariedade ao MTX em pacientes com AR podem estar relacionados com uma deficiência na atividade bioquímica e função supressora de células Tregs, focando principalmente na expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73. Pacientes e Métodos: No presente estudo, amostras do sangue periférico de pacientes com AR (n= 89) e doadores saudáveis (n =16) foram coletadas. Por citometria de fluxo, as populações leucocitárias de PBMC foram fenotipadas para a avaliação da expressão das ectonucleotidases CD39 e CD73 nos diferentes tipos celulares. A atividade das ectonucleotidases em células TCD4+ na geração de ADO extracelular foi avaliada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC) e ensaios colorimétricos de Verde Malaquita. Resultados: Citocinas inflamatórias IL-1 e TNF- presentes no plasma e a frequência de células TCD4+ produtoras de IL-17 e IFN- estavam significativamente aumentadas em pacientes não responsivos ao MTX (UR-MTX; DAS28- 5,87±0,52; média de idade- 54,7 anos) quando comparadas com pacientes responsivos (R-MTX; DAS28- 2,23±0,57; média de idade- 52,6 anos) e indivíduos saudáveis (IS). Na caracterização fenotípica dos leucócitos de PBMC, não houve diferença na porcentagem de linfócitos TCD4+, TCD8+, células B e células dendríticas entre os grupos analisados. No entanto, observamos um aumento significativo na porcentagem de células Tregs (CD4+CD25+ FoxP3+) em pacientes R-MTX. De maneira interessante, enquanto que a porcentagem de células Tregs expressando CD73 não estava alterada, observou-se um aumento da frequência desta população celular expressando CD39 em pacientes R-MTX. Adicionalmente, a ADO extracelular presente no sobrenadante de células Tregs de pacientes UR-MTX estava reduzida quando comparada aos outros grupos, visto que esse grupo de pacientes também apresenta uma expressão reduzida de CD39 na superfície das Tregs. Conclusão: Em conjunto estes resultados demonstram que a refratariedade de pacientes ao MTX é associada com o número e funções das Tregs, especialmente na geração de ADO extracelular. Esses achados podem gerar novas perpectivas em intervenções terapêuticas para tratamento da AR, proporcionando avanços na escolha de drogas rotineiramente utilizadas para tratar a doença.