Les virus oncolytiques sont une nouvelle classe d’agents thérapeutiques pouvant être une alternative au traitement des cancers. Plusieurs virus oncolytiques sont actuellement développés en clinique, néanmoins de nombreuses améliorations sont à apporter afin de créer une nouvelle classe de virus plus efficaces et moins toxiques. Le premier objectif de cette thèse a été d’améliorer la spécificité tumorale du virus de la vaccine via le ciblage de l’antigène MUC1 présenté à la surface des cellules tumorales. Pour cela un virus recombinant présentant à sa surface un fragment d’anticorps (scFv) dirigé contre l’antigène tumoral MUC1 a été construit et produit. Les tests in vitro n’ont toutefois pas permis de mettre en évidence un ciblage spécifique du virus recombinant. Un deuxième aspect de cette thèse a été de tester le potentiel oncolytique de virus de la famille des Poxviridae. Durant ce travail de thèse, les capacités oncolytiques de douze poxvirus, appartenant à 8 genres différents, ont été étudiés. Leurs effets sur la prolifération de cellules cancéreuses humaines ont été évalués. Les virus caractérisés par un effet oncolytique élevé ont été, par la suite, modifiés et armés par ingénierie virale afin d’augmenter leur efficacité. La dernière partie de cette thèse a été consacrée à la génération et la sélection de virus chimériques basées sur la méthode d’évolution dirigée. Cette méthode est utilisée pour mimer le processus naturel de sélection évolutif. Appliqué à la virothérapie oncolytique, ce procédé nous a permis de générer un nouveau virus oncolytique chimérique caractérisé par un potentiel anti-cancéreux amélioré. En résumé, cette thèse a permis, par des techniques d’ingénierie virale, par un criblage de nouveaux virus et par la méthode d’évolution dirigée, de créer et de sélectionner une nouvelle génération de poxvirus oncolytiques présentant une activité thérapeutique accrue avec un profil de toxicité atténué et pouvant être utilisés dans diverses indications thérapeutiques. / Oncolytiques viruses are a new class of therpeutic agents which could be an alternative for cancer treatment. Currently, several oncolytic viruses are evaluated in clinical trial, nevertheless improvements are needed to create a new class of more efficiente and less toxic viruses. The first objective of this thesis was to improved the vaccinia virus specificity through the targeting of the tumor-associated antigen MUC1. To address this goal, a recombinant virus expressing an scFv targeting the MUC1-protein was engineered and produced. However, in vitro, the demonstration of a specific targeting by the recombinant virus was not possible. A second aspect of this thesis work was to evaluate the oncolytic potential of Poxviridae family viruses. Oncolytic capacities of twelve viruses, belonging to eight genera, were evaluated. Their impact on human cancer cells was tested. In order to increase their efficacity, viruses with the highest oncolytic capacities were then modified and armed by genetic engineering. The third part of this work was devoted to the generation of chimeric viruses based on directed evolution process. This methodology is used to mimic the natural process of evolutionary selection. Applied to oncolytic virotherapy, this technique allowed the generation of a new chimeric oncolytic virus caracterised by an enhanced antitumoral potential. In summary, this thesis has allowed, through viral engineering, poxviruses screening and directed evolution methodology, the creation and selection of a new generation of oncolytic poviruses. These viruses demonstrate an increased therpeutic activity and greatest safety profil enabling their application in several therapeutic indication.