名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 博士(医学)(課程) 学位授与年月日:平成2年11月22日 竹中徳哉氏の博士論文として提出された

O câncer de mama é a neoplasia de maior ocorrência na população feminina. É uma doença hormônio-dependente com etiologia complexa e multifatorial. O câncer de mama invasivo é uma das principais causas da morbidade e mortalidade de mulheres no mundo. O desenvolvimento e a progressão de câncer de mama estão associados com acúmulo de várias alterações genéticas e epigenéticas, que resultam na expressão gênica diferencial entre células normais e tumorais. A hipóxia pode ser considerada uma das características principais de tumores sólidos e uma força motriz para a sobrevida das células tumorais e progressão maligna. O gene supressor de tumor PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; também denominado PAR-4, prostate apoptosis response-4) tem importante papel na apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca e pode ser considerado um alvo para a terapia seletiva de células tumorais uma vez que a expressão de PAR-4 aumenta a sensibilidade da maioria das células de câncer a um segundo estímulo apoptótico. Alguns estudos, incluindo os de nosso grupo, têm mostrado o envolvimento de PAR-4 em câncer de mama e seu papel como fator prognóstico e preditivo de resposta a quimioterapia. No entanto, pouco é conhecido sobre o papel funcional deste gene ou os mecanismos envolvidos na regulação da expressão de PAR-4 na glândula mamária e no processo de tumorigênese da mama. No presente trabalho investigamos os efeitos da hipóxia na expressão de PAR-4 nas linhagens celulares MCF10A, MCF7 e MDA-MB-231. Para isto, as células foram incubadas por períodos de 30 minutos, 1, 2, 6 ou 24 horas em ambiente controlado com 5 % CO2, 95% N2 e 0.2% O2. A expressão de Par-4 foi avaliada quanto aos transcritos, por PCR em Tempo Real e quanto à expressão protéica, por western blot. Observamos que a baixa concentração de oxigênio diminui a expressão do mRNA de PAR-4, em tempos de 6 e 24 horas, nas linhagens MCF10A e MCF7 e no tempo de 24h nas células MDA-MB-231. Já quando os níveis protéicos de Par-4 foram analisados não foi observada diferença significativa nessas células após exposição à condição de hipóxia. A expressão do gene NDRG1, a qual se encontra aumentada em condições de hipóxia, foi utilizada como controle. Nossos dados sugerem que a expressão dos transcritos do gene supressor de tumor PAR-4 é inibida pelos mecanismos celulares de sobrevivência celular ativados durante a hipóxia / Breast cancer has the highest incidence rate of all malignant neoplasias affecting women. It is a hormone dependent disease with complex and multifactorial etiology. Invasive breast cancer is one of the principal causes of women morbidity and mortality in the world. Breast cancer development and progression are associated with accumulation of various genetic and epigenetic alterations, which result in differential gene expression among normal and tumor cells. Hypoxia could be considered one of the principal hallmarks of solid tumors and the driving force for the tumor cell survival and malignant progression. The tumor suppressor gene PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; also known as PAR-4, prostate apoptosis response-4) has an important role in apoptosis either by intrinsic or extrinsic pathways and could be considered as a target for selective therapy of tumor cells. Some studies, including of our group, have shown the PAR-4 involvement in breast cancer and its role as prognostic and predictive factor in response to chemotherapy. However, little is known about functional role of this gene or the mechanisms involved in PAR-4 expression regulation in mammary gland and in breast tumorigenesis process. In the present study we evaluated the hypoxia effects on PAR-4 expression in MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cell lines. Therefore, the cells were incubated for time periods of 30 minutes, 1, 2, 6 or 24 hours under controlled environment with 5 % CO2, 95% N2 e 0.2% O2. PAR-4 expression was evaluated for transcripts, by Real Time PCR, and for protein expression, by western blot. We observed that low oxygen concentration decreases PAR-4 mRNA expression, in periods of 6 and 24 hours, in MCF10A and MCF7 cell lines and in the period of 24 hours in MDA-MB-231 cells. However, when the Par-4 protein levels were evaluated, no significant difference was observed in these cells after incubation under hypoxic conditions. NDRG1 gene expression, which is increased under hypoxia, was used as a control. Our data suggest that the expression of tumor suppressor gene PAR-4 transcripts is inhibited by cell survival mechanisms activated during hypoxia

O câncer de mama é a neoplasia de maior ocorrência na população feminina. É uma doença hormônio-dependente com etiologia complexa e multifatorial. O câncer de mama invasivo é uma das principais causas da morbidade e mortalidade de mulheres no mundo. O desenvolvimento e a progressão de câncer de mama estão associados com acúmulo de várias alterações genéticas e epigenéticas, que resultam na expressão gênica diferencial entre células normais e tumorais. A hipóxia pode ser considerada uma das características principais de tumores sólidos e uma força motriz para a sobrevida das células tumorais e progressão maligna. O gene supressor de tumor PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; também denominado PAR-4, prostate apoptosis response-4) tem importante papel na apoptose tanto pela via intrínseca quanto pela via extrínseca e pode ser considerado um alvo para a terapia seletiva de células tumorais uma vez que a expressão de PAR-4 aumenta a sensibilidade da maioria das células de câncer a um segundo estímulo apoptótico. Alguns estudos, incluindo os de nosso grupo, têm mostrado o envolvimento de PAR-4 em câncer de mama e seu papel como fator prognóstico e preditivo de resposta a quimioterapia. No entanto, pouco é conhecido sobre o papel funcional deste gene ou os mecanismos envolvidos na regulação da expressão de PAR-4 na glândula mamária e no processo de tumorigênese da mama. No presente trabalho investigamos os efeitos da hipóxia na expressão de PAR-4 nas linhagens celulares MCF10A, MCF7 e MDA-MB-231. Para isto, as células foram incubadas por períodos de 30 minutos, 1, 2, 6 ou 24 horas em ambiente controlado com 5 % CO2, 95% N2 e 0.2% O2. A expressão de Par-4 foi avaliada quanto aos transcritos, por PCR em Tempo Real e quanto à expressão protéica, por western blot. Observamos que a baixa concentração de oxigênio diminui a expressão do mRNA de PAR-4, em tempos de 6 e 24 horas, nas linhagens MCF10A e MCF7 e no tempo de 24h nas células MDA-MB-231. Já quando os níveis protéicos de Par-4 foram analisados não foi observada diferença significativa nessas células após exposição à condição de hipóxia. A expressão do gene NDRG1, a qual se encontra aumentada em condições de hipóxia, foi utilizada como controle. Nossos dados sugerem que a expressão dos transcritos do gene supressor de tumor PAR-4 é inibida pelos mecanismos celulares de sobrevivência celular ativados durante a hipóxia / Breast cancer has the highest incidence rate of all malignant neoplasias affecting women. It is a hormone dependent disease with complex and multifactorial etiology. Invasive breast cancer is one of the principal causes of women morbidity and mortality in the world. Breast cancer development and progression are associated with accumulation of various genetic and epigenetic alterations, which result in differential gene expression among normal and tumor cells. Hypoxia could be considered one of the principal hallmarks of solid tumors and the driving force for the tumor cell survival and malignant progression. The tumor suppressor gene PAWR (PKC apoptosis WT1 regulator; also known as PAR-4, prostate apoptosis response-4) has an important role in apoptosis either by intrinsic or extrinsic pathways and could be considered as a target for selective therapy of tumor cells. Some studies, including of our group, have shown the PAR-4 involvement in breast cancer and its role as prognostic and predictive factor in response to chemotherapy. However, little is known about functional role of this gene or the mechanisms involved in PAR-4 expression regulation in mammary gland and in breast tumorigenesis process. In the present study we evaluated the hypoxia effects on PAR-4 expression in MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cell lines. Therefore, the cells were incubated for time periods of 30 minutes, 1, 2, 6 or 24 hours under controlled environment with 5 % CO2, 95% N2 e 0.2% O2. PAR-4 expression was evaluated for transcripts, by Real Time PCR, and for protein expression, by western blot. We observed that low oxygen concentration decreases PAR-4 mRNA expression, in periods of 6 and 24 hours, in MCF10A and MCF7 cell lines and in the period of 24 hours in MDA-MB-231 cells. However, when the Par-4 protein levels were evaluated, no significant difference was observed in these cells after incubation under hypoxic conditions. NDRG1 gene expression, which is increased under hypoxia, was used as a control. Our data suggest that the expression of tumor suppressor gene PAR-4 transcripts is inhibited by cell survival mechanisms activated during hypoxia