This thesis shows advancements towards the development of engineered bacteria for sensing and responding to environmental pollutants by exploring the use of UDP-glycosyltransferases (UGTs) for their metabolism of toxins, along with the use of engineered tetracycline repressor protein (TetR) based transcriptional regulators as sensors for environmental toxins. The importance and applicability of UGTs as well as the adaptability of TetR systems for future developments are shown through a function-based review of UGTs, the development of high-throughput fluorescent UGT assay technique, and the creation of novel TetR transcription regulatory sequences. The assays effectively measured UGT71G1 activity based on the presence of reaction byproducts, leading to the identification of several new substrates including the toxin bisphenol A. Next, hybrid TetRs were assembled from complementary DNA-binding and ligand-binding domains of TetR homologs. The ability to interchange these domains while retaining their function multiplies the unique TetR systems available for use in cellular systems. In future, novel TetR and UGT71G1 systems may be developed to detect and respond to substrates like bisphenol A.

Uridine diphosphate glycosyltransferase (UGT) is a multigene family of enzymes responsible for catalyzing glycosylation of small hydrophobic molecules. Recently, a genomic analysis of the corn earworm (Helicoverpa zea) identified 45 different UGT genes. We discovered a UGT gene (UGT34) showing high levels of expression exclusively in the silk gland tissue. The expression levels of UGT34 were analyzed in different developmental stages and silk gland sub-segments, revealing that UGT34 is generally expressed at all larval instar stages and largely expressed in the middle and posterior subsegments of the silk glands. The soybean looper (Chrysodeixis includens), another noctuid moth species, was analyzed and found to have similar gene expression patterns. To determine UGT34 function RNA interference (RNAi) was used, but it revealed to be unsuccessful. Taken together, the present study implies that UGT34 plays an important role in silk glands, yet its molecular and physiological function needs to be determined by further study.

Pour s’adapter à leur environnement, les plantes ont acquis la capacité de produire une grande quantité de métabolites spécialisés à partir d’un nombre limité de structures de base. Parmi les modifications apportées à ces structures de base, la réaction de glycosylation permet d’augmenter la solubilité du composé, de réduire sa toxicité et de contribuer à une meilleure stabilité de certaines molécules ayant pour conséquence la modification de leur transport et/ou de leur stockage. Les UDP-glycosyltransférases (UGT) forment une vaste famille de glycosyltransférases chez les plantes. Elles regroupent des enzymes glycosylant principalement des hormones et des phénylpropanoides en utilisant l’UDP-sucre comme donneur de sucre. L’objectif de ce travail consiste à contribuer à la caractérisation fonctionnelle de la famille des UGT72 chez le peuplier afin d’identifier le rôle de ses membres dans les processus développementaux liés aux arbres et dans leurs réponses au stress. Plusieurs membres de cette famille ont déjà été caractérisés chez d’autres espèces comme A. thaliana, M. truncatula et C. sinensis, mettant en évidence la capacité de certaines UGT72s à glycosyler les monolignols, une implication dans le processus de lignification, un rôle dans des processus de défense contre les pathogènes ou encore une fonction de détoxification de certains polluants. Parmi les 8 UGT72s identifiées chez le peuplier, nous avons montré qu’in vitro UGT72AZ2 glycosyle l’acide férulique et l’acide sinapique, UGT72B37 le p-coumaraldéhyde, le coniféraldéhyde, le sinapaldéhyde, le coniferyl alcool et le sinapyl alcool, UGT72B39 le coniféryl alcool et UGT72A2 la naringénine. Tous les membres de la famille UGT72 sont exprimés dans les tissus vasculaires, suggérant un rôle dans le développement vasculaire. La surexpression de UGT72AZ1 ou UGT72AZ2 provoque l’accumulation de glucosides de monolignols (respectivement coniférine et syringine ou coniférine seulement), sans toutefois affecter la quantité totale de lignine. Concernant la localisation subcellulaire, excepté pour UGT72A2, les UGT72s du peuplier sont localisées dans le réticulum endoplasmique et le noyau, suggérant respectivement, un rôle dans la régulation de la voie des phénylpropanoides et dans la maintenance de l’ADN. UGT72A2 se démarque des autres membres de cette famille, car elle est localisée dans les chloroplastes et dans des vésicules associées aux chloroplastes, suggérant un rôle dans la régulation des phénylpropanoides dans le chloroplaste et/ou dans la maintenance du chloroplaste. En appui de ces hypothèses, nous avons constaté que la photosynthèse est affectée dans les lignées sous-exprimant UGT72A2, provoquant un jaunissement des feuilles. De plus, les feuilles de lignées sous-exprimant UGT72A2 développent un stress oxydatif associé à une réduction de l’accumulation des flavonoïdes et de l’activité des enzymes antioxydantes, suggérant un rôle de UGT72A2 dans l’homéostasie des formes réactives de l’oxygène (ROS). / In order to adapt to their environment, plants have developed the capacity to produce a diversified range of specialized metabolites by modifying a core set of molecules. Among those modifications, glycosylation allows to increase the solubility, to reduce the toxicity and to stabilize compounds in order to modify their transport and/or allow their storage. The UDP-glycosyltransferases (UGT) forming the largest glycosyltransferase superfamily in plants, combine enzymes which glycosylate mainly hormones and phenylpropanoids by using UDP-sugar as sugar donor. The purpose of this dissertation is to contribute to the functional characterization of the UGT72 family in poplar to unravel the role of its members in tree developmental processes and in stress response. Members of this family already characterized in other species (e.g. Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula and Camellia sinensis) have been found to glycosylate monolignols and some of them have been associated with lignification, defence against pathogens and detoxification of pollutants. Among the 8 UGT72s identified in poplar, we have shown that UGT72AZ2 glycosylates in vitro ferulic acid and sinapic acid, UGT72B37 p-coumaraldehyde, coniferaldehyde, sinapaldehyde, coniferyl alcohol and sinapyl alcohol, UGT72B39 coniferyl alcohol and UGT72A2 naringenin. All the UGT72 members are expressed in vascular tissues suggesting a role in vascular development. The overexpression of UGT72AZ1 or UGT72AZ2 in poplar triggers the accumulation of monolignol glucosides (both coniferin and syringin or only coniferin, respectively) but has no impact on lignin content. With respect to the subcellular localization, except for UGT72A2, poplar UGT72s are localized in the endoplasmic reticulum and in the nucleus suggesting a possible role in the phenylpropanoid pathway regulation and in DNA maintenance, respectively. UGT72A2 stands out from the other poplar UGT72s by being localized in the chloroplast and chloroplast associated bodies, suggesting a role in the phenylpropanoid regulation in chloroplasts and/or in chloroplast maintenance. Moreover, supporting these hypotheses, photosynthesis was affected in lines downregulated for UGT72A2, as shown by a leaf yellowing phenotype and an oxidative stress in these lines as compared to the wild type. The flavonoid biosynthesis and the activity of enzymes involved into the reactive oxygen species (ROS) scavenging seem to be reduced by the downregulation of UGT72A2 suggesting a role of this UGT in the ROS homeostasis. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La fusariose des épis est l’une des principales maladies des céréales, majoritairement causée par le champignon pathogène et toxinogène, Fusarium graminearum (Fg). Lors son développement in planta, le champignon produit des mycotoxines dommageables pour la santé humaine et animale, dont le déoxynivalénol (DON). De nombreux loci à effet quantitatif sur la résistance à Fg ont été identifiés chez le blé tendre. Certains d’entre eux ont été corrélés à la capacité à détoxifier le DON, en particulier par glucosylation sous l’action d’UDP-glucosyltransférases (UGT). Une UGT d’orge impliquée dans la conjugaison du DON a été identifiée en système hétérologue. Brachypodium distachyon (Bd) a récemment émergé comme modèle d’étude pour les céréales. Ce travail à l’aide d’approches transcriptomique et métabolomique a mis en évidence que lors de l’interaction avec Fg, Bd met en place des réponses macroscopiques, moléculaires et métaboliques similaires à celles connues chez le blé et l’orge. La recherche d’UGTs candidates capables de conjuguer le DON en DON-3-O-glucoside (D3G) chez Bd a permis l’identification d’un candidat. L’analyse fonctionnelle du gène correspondant a été conduite par des approches de mutagenèse et de surexpression. Ceci a montré une sensibilité accrue des lignées mutantes à la toxine et à l’agent pathogène. A l’inverse les lignées surexpresseurs ont montré une tolérance et résistance quantitative à la toxine et l’agent pathogène. Ces résultats ont été corrélés par la détection in planta de DON et D3G, dans des proportions variables selon les lignées. Ces résultats démontrent le rôle majeur que joue la glucosylation du DON dans l’établissement de la résistance observée chez Bd en réponse à Fg. / Fusarium head blight is a major cereal disease, mostly caused by the pathogenic and toxin-producing fungus, Fusarium graminearum (Fg). During its development in planta, the fungus produces mycotoxins harmful to human and animal health, including deoxynivalenol (DON). Many quantitative trait loci exhibiting an effect on resistance to Fg have been identified in wheat. Some of them were correlated with the ability to detoxify DON, particularly by glucosylation by UDP-glycosyltransferases (UGT). A barley UGT involved in the conjugation of DON was identified in a heterologous system. Brachypodium distachyon (Bd) has recently emerged as a model species for cereals. Using transcriptomic and metabolomic approaches, we show that when interacting with Fg, Bd implements macroscopic, molecular and metabolic responses similar to those known in wheat and barley. The search for UGT candidates able to conjugate DON into DON-3-O-glucoside (D3G) in Bd resulted in the identification of the Bradi5g03300 gene. Functional analyses of this gene showed increased sensitivity of the mutant lines to the toxin and to the pathogen. Conversely the overexpressor lines showed a tolerance to the toxin and quantitative resistance to Fg. These results were correlated with the detection of differential amounts of DON and D3G in the different lines. These results demonstrate the important role of DON glucosylation in the resistance establishment of Bd observed in response to Fg.