Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. Tesis para optar Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / La biomineralización patológica de oxalato de calcio (CaOx) dentro del tracto urinario produce una enfermedad denominada urolitiasis. El CaOx presenta tres variedades en la naturaleza: CaOx monohidratado (COM), CaOx dihidratado (COD) y CaOx trihidratado (COT). Dentro de estos últimos COD y COM representan los polimorfos mayoritarios en los cálculos urinarios en mamíferos. Distinta formas de obtener cristales se han descrito a lo largo de los años, sin embargo, recientemente la electrocristalización se ha descrito como una técnica que permite obtener de manera fácil y rápida cristales de CaOx. En esta Tesis de Magíster se realizaron ensayos de electrocristalización de CaOx modificando variables experimentales tales como: apertura/cierre de celda electroquímica, temperatura y corriente eléctricas. Finalmente en presencia de aditivos, como es citrato y nanotubos de carbono multipared funcionalizados con diferentes compuestos acídicos: ácido itacónico (AI), monometilitaconato (MMI) y mono-octadecil-itacontato (MODI) fueron evaluados como moldes en los ensayos de electrocristalización de CaOx. Los resultados experimentales mostraron que fue posible controlar selectivamente la morfología de cristales CaOx al variar las variables antes mencionadas obteniendo cristales COM y COD en los ensayos de electrocristalización in vitro. Las variables temperatura y cierre de la celda electroquímica afectaron la nucleación, crecimiento y agregación de cristales CaOx. La superficie de los WE fue cubierta por cristales CaOx de gran tamaño (>100 μm) en celdas electroquímicas (ECCs) sometidas a 60°C. Por otra parte, se obtuvo cristales CaOx de menor tamaño (3 μm a 20 μm) en ECCs sometidas a temperaturas de 23°C. La difracción de rayos-X (XRD) fue utilizada para evaluar la estructura cristalográfica de los cristales CaOx formados en los diferentes ensayos de electrocristalización. La técnica de XRD de CaOx mostró difractogramas correspondiente a COM con predominancia del plano cristalográfico (222), las cuales fueron identificadas por la aparición de picos de difracción entre 25,8-26,2°, e intensidad mayor a 70.000 (u.a). En resumen, MWCNT funcionalizados con grupos acídicos resultaron ser inhibidores más eficientes que el citrato y un orden de inhibición como sigue: MODI < MMI < IA. De esta forma, nuestros resultados sugieren que la técnica de electrocristalización constituiría un método de cristalización efectivo y novedoso para evaluar nuevos aditivos y/o moldes moduladores de la morfología, estructura y polimorfismo de CaOx. / The pathological biomineralization of calcium oxalate (CaOx) within the urinary tract causes a disease called urolithiasis. CaOx has three varieties in Nature: CaOx monohydrate (COM), CaOx dihydrate (COD) and CaOx trihydrate (COT). Among the latter COD and COM represent the majority polymorphs in urinary calculi in mammals. Different ways to obtain crystals have been described over the years; however, recently electrocrystallization has been described as a technique to obtain easily and quickly CaOx crystals. This Master thesis conducted trials of electrocrystallization CaOx modifying experimental variables such as opening/closing electrochemical cell, temperature (T °) and current (V). Finally in the presence of additives, as is citrate and carbon nanotubes multiwall functionalized (MWCNT-FN) with various acidic compounds: itaconic acid (IA), monometilitaconato (MMI) and monooctadecyl itacontato (MODI) were evaluated as templates in CaOx electrocrystallization assays. The experimental results showed that it was possible to selectively control the morphology of CaOx crystals by varying the variables above mentioned inducing COD COM crystals in the in vitro electrocrystallization assays. The variables temperatura (T°) and closing of the electrochemical cell affected nucleation, crystal growth and aggregation of CaOx. The WE surface was covered by the presence of large CaOx crystals (> 100 μm) in electrochemical cells (ECCs) under 60 °C. On the other hand, smaller CaOx crystals (3 μm to 20 μm) was obtained in CCTs under lowerer temperatures (23°C). The X-ray diffraction (XRD) analysis showed a typical COM diffractogram with predominance of crystallographic faces (222), which were identified by the appearance of diffraction peaks between 25,8-26,2°, and the greater intensity 70,000 (u.a). In summary, functionalized MWCNT with acidic groups they were found to be more efficient than citrate and all of them showed the follow inhibition order: MODI <MMI <IA. Thus, our results suggest that the electrocrystallization technique should be an effective and novel crystallization method to evaluate new additives and/or modulators templates of the morphology, structure and polymorphism of CaOx. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt no. 1140660.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El oxalato de calcio (CaOx) es el principal componente de los cálculos renales humanos. El CaOx presenta tres polimorfos cristalinos: CaOx monohidratado (COM), dihidratado (COD) y trihidratado (COT), siendo COM encontrados mayormente en pacientes litogénicos. En personas sanas la presencia de determinadas biomoléculas, inhibe la formación de COM y promueve la formación de COD. En este estudio se sintetizaron dos polimetilsiloxanos (PMS) funcionalizados con grupos sulfónicos (I-SO3H-PMS y II-SO3H-PMS) y se evaluaron sus efectos modificadores en la cristalización CaOx in vitro. Estos polímeros se prepararon mediante reacciones de hidrosilación y sulfonación usando poli (dimetil siloxano-co-hidrógeno metilsiloxano) como polímero de partida. Se preparó un derivado de I-SO3H-PMS acoplado a una molecula fluorescente fluorescein-5-thiosemicarbazide y se evaluó su efecto como aditivo para conocer la adsorción de SO3H-PMS en cristales CaOx. El análisis morfológico de cristales de CaOx, mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), demostró que cristales monoclínicos COM son formados en ausencia de SO3H-PMS. Sin embargo, variando la concentración de SO3H-PMS en los ensayos de cristalización de CaOx se induce una transición de COM a morfologías de tipo multicapa y circular de hojas apiladas y la aparición de cristales COD tetragonales bi-piramidales. Se realizaron análisis de composición química y estructural de los cristales mediante EDS y XRD, respectivamente. Mediante EDS, se determinó la presencia de átomos de Si del polímero SO3H-PMS, adsorbido en las superficies CaOx y, a través de XRD se describió la formación selectiva de cristales COM y COD. Se obtuvieron formas fluorescentes de CaOx con morfologías truncadas y redondeadas usando el aditivo fluorescente de SO3H-PMS. En conclusión, se demostró que la presencia de grupos sulfónicos en la cadena principal PMS y la su concentración alteró la morfología, polimorfismo, nucleación y distribución del tamaño de los cristales de CaOx / Financiamiento: Proyecto Fondecyt No.1110194

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.