Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-04-29T22:12:56Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_InfeccaoPersistenteFlavivirus.pdf: 1464157 bytes, checksum: d9dd45388b44f0a8fb4a86e49f6842e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-05-02T16:10:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_InfeccaoPersistenteFlavivirus.pdf: 1464157 bytes, checksum: d9dd45388b44f0a8fb4a86e49f6842e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-02T16:10:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_InfeccaoPersistenteFlavivirus.pdf: 1464157 bytes, checksum: d9dd45388b44f0a8fb4a86e49f6842e0 (MD5) Previous issue date: 2009 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Os arbovírus Ilhéus (VILH) e Rocio (VROC) são flavivirus (família Flaviviridae, gênero Flavivirus) de grande importância para a saúde pública no Brasil por estar relacionados a casos de encefalites em humanos. Sabe-se que outros flavivírus estão envolvidos com a infecção persistente in vitro, in vivo e em relatos clínicos. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi investigar a possível ocorrência de infecção persistente in vivo dos VILH e VROC utilizando hamsters dourados jovens (Mesocricetus auratus) como modelo experimental. Os hamsters foram inoculados com suspensão de cérebros de camundongos recém-nascidos infectados com títulos de 9,8 e 9,6 DL50/0,02 mL do VROC e VILH respectivamente, pela via intraperitoneal, sendo em seguida a intervalos pré-determinados, anestesiados e sacrificados para coleta de amostras de sangue, soro, urina e órgãos durante quatro meses (120 dias) pós-inoculação (p.i.). A quantificação viral foi calculada em amostras de cérebro, fígado e sangue, pela técnica de RT-PCR em tempo real (qRT-PCR). Todas as amostras coletadas foram inoculadas em célula VERO para confirmação de replicação viral, sendo detectados antígenos virais pelo teste de imunofluorescência indireta (IFI), os níveis de anticorpos foram determinados pelo teste de inibição da hemaglutinação. Exame histopatológico por hematoxilina-eosina e detecção de antígenos virais por imunohisquímica foram avaliados nas amostras de vísceras e encéfalos coletados durante a cinética. O estudo demonstrou que hamsters dourados jovens constituem um bom modelo experimental para infecção persistente pelos flavivírus VILH e VROC. Os dois vírus induziram uma forte resposta imune, embora os níveis de anticorpos para o VILH tenham sido maior do que para o VROC; já o VROC mostrou-se mais patogênico nestes animais, sugerindo uma capacidade de neurovirulência maior que o VILH. Das amostras coletadas dos hamsters infectados e inoculadas em células VERO foi possível isolar ambos os vírus a partir de todos os órgãos, sangue, soro e urina, sendo confirmada a replicação viral por IFI. Quanto à infecção persistente, o VROC foi detectado, pela técnica de qRT PCR, por três meses p.i., no cérebro, fígado e sangue, enquanto o VILH apresentou persistência viral apenas no cérebro durante 30 dias p.i. por qRT PCR. O VROC foi capaz de produzir alterações histopatológicas e células imuno-marcadas expressando antígenos virais nas amostras de fígado, rim, pulmão e cérebro por quatro meses. Ao passo que para o VILH, as alterações histopatológicas e a expressão de antígenos virais nas amostras de fígado, rim e pulmão ocorreram por 30 dias p.i.; e no cérebro por quatro meses p.i.; Os achados deste estudo demonstraram que ambos os vírus apresentaram capacidade de causar infecção persistente em hamsters infectados por via periférica, sendo necessários mais estudos para determinar os mecanismos fisiopatológicos e a patogênese de estabelecimento dessas infecções persistentes. / Ilheus (ILHV) and Rocio (ROCV) are flaviviruses (family Flaviviridae, genus Flavivirus) of great importance to public health in Brazil because these viruses are associated to encephalitis cases in humans. Recent studies have reported persistence of experimental infections (in vivo and in vitro) and clinical reports. The purpose of this study was to investigate in vivo the possible occurrence of persistent infection caused by ILHV and ROCV using young golden hamsters (Mesocricetus auratus) as experimental model. Hamsters were inoculated intraperitoneally with a suspension of brains of newborn mice infected with titers of 9.8 and 9.6 DL50/ 0.02 mL of ROCV and ILHV respectively, and at pre-determined intervals, they were anesthetized and sacrificed for collection of blood samples, serum and urine and organ fragments during four months (120 days) post-inoculation (p.i.). Viral quantification was calculated in samples of brain, liver and blood, using the technique of Real Time RT-PCR (qRT-PCR). All collected specimens were inoculated into VERO cells for confirmation of viral replication; and viral antigens in the cell cultures were detected by indirect immunofluorescence test; the levels of antibodies were determined by hemagglutination-inhibition test. Histopathological examination by hematoxylin-eosin and detection of viral antigens by imunohistochemistry were assayed in viscera and central nervous tissue samples collected during the kinetics. The study showed that young golden hamsters are good experimental model for persistent infection by the flaviviruses ILHV and ROCV. Both viruses induced strong immune response, although the levels of antibodies to ILHV were greater than for ROCV. The ROCV has demonstrated to be more pathogenic in these animals, suggesting higher ability to cause neuronal invasiveness than ILHV. Infected viscera samples inoculated in VERO cells resulted in growth of both viruses from all infected organ, blood, serum and urine samples and were confirmed by indirect immunofluorescence assay. Regarding persistence of infection, ROCV was detected in the brain, liver and blood by qRT-PCR, for three months p.i., while ILHV persistence was observed only in the brain for 30 days p.i. by qRT-PCR. The ROCV was able to produce histopathological changes, and immuno-labeled cells expressing viral antigens in liver, kidney, lung and brain samples during four month were confirmed by imunohistochemistry. To the ILHV, the histopathological changes and expression of viral antigens in samples from the liver, kidney and lung were only confirmed up to 30 days p.i., but the brain was positive for four months p.i.; The findings obtained in this study showed that both viruses have capacity to cause persistent infection in hamsters intraperitoneally infected, studies additional are needed to determine the pathophysiology and pathogenesis of ILHV and ROCV persistent infections.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-26T14:06:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ReplicacaoViralPadrao.pdf: 2703656 bytes, checksum: ccbaf5da11f1dbae865d35717cc46fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-27T13:37:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ReplicacaoViralPadrao.pdf: 2703656 bytes, checksum: ccbaf5da11f1dbae865d35717cc46fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:37:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ReplicacaoViralPadrao.pdf: 2703656 bytes, checksum: ccbaf5da11f1dbae865d35717cc46fc9 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os arbovírus pertencentes ao gênero Flavivirus (Família Flaviviridae) são responsáveis por considerável morbi-mortalidade, podendo causar quadros graves de encefalite, febre hemorrágica, hepatite e doença febril em vertebrados, incluindo humanos. O flavivírus Rocio (VROC) é de grande importância para a saúde pública no Brasil, pois representa uma grave ameaça de ocorrência de súbitos surtos de encefalite. A imunopatologia das encefalites causadas por flavivírus ainda não está completamente esclarecida e muitos aspectos inerentes à modulação das respostas imunes do SNC carecem por ser desvendados. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de expressão gênica de citocinas em cultura primária de células neurais submetidas à infecção pelo vírus Rocio. Culturas primárias mistas (neurônio/glia), obtidas a partir de cérebros de camundongos isogênicos neonatos da linhagem BALB/c, foram inoculadas com o VROC (MOI igual a 2) no sétimo dia de cultivo, a confirmação da infecção foi feita por imunocitoquímica (anti-VROC). Quantificou-se a replicação viral nas culturas primárias infectadas, em função do período infeccioso, pelo método da titulação viral. O RNA celular total foi extraído e utilizado para a detecção de citocinas através da técnica de RT-qPCR em tempo real. O estudo demonstrou que cultura primária de células neurais constitui um bom modelo experimental para estudo de infecções do SNC pelo flavivírus Rocio. O VROC infectou eficientemente a cultura primária de células neurais gerando alterações citopatogênicas a partir do 2º dia p.i., momento em que se detectou maior título viral. A cultura primária infectada com o VROC sobreviveu até 7 dias p.i. e a quantificação da carga viral revelou uma cinética de replicação viral compatível com a cinética de morte celular da cultura infectada pelo VROC. Durante os cinco primeiros dias p.i. da cultura primária, houve redução da expressão gênica de INF-α, INF-β, INF-γ e IL-1β, não houve alteração na expressão de TNF-α e houve aumento na expressão de TGF-β no 1º, 3º e 5º dia p.i. Os achados deste estudo sugerem que o VROC tem a capacidade de regular negativamente a expressão de citocinas moduladoras das respostas imunes antivirais e inflamatórias e que, neste modelo experimental, a imunorregulação exercida pelo TGF-β predomina sobre a modulação das respostas imunes antivirais e inflamatórias, sendo necessários maiores estudos para elucidar a imunopatologia da infecção do SNC pelo VROC. / Arboviruses belonging to the genus Flavivirus (Flaviviridae family) are responsible for considerable morbidity and mortality, may cause severe cases of encephalitis, hemorrhagic fever, hepatitis and febrile disease in vertebrates, including humans. Rocio flavivirus (ROCV) is very important for public health in Brazil, as it represents a serious threat of occurrence of sudden encephalitis outbreaks. The immunopathology of encephalitis caused by flavivirus is not yet fully understood and many aspects involved in modulation of immune responses in the CNS need to be unraveled. Thus, the aim of this study was to analyze the pattern of gene expression of cytokines in primary culture of neural cells when exposed to infection with Rocio. Mixed primary cultures (neuron/glia), obtained from the brains of BALB/C lineage isogenic newborns mice were inoculated with ROCV (MOI equal to 2) on the seventh day of culture and confirmation of infection was made by immunocytochemistry (anti-VROC). Viral replication was quantified in infected primary cultures, depending on the infectious period, by viral titer method. Total cellular RNA was extracted and used for detection of cytokines by real time RT-qPCR techniques. The study showed that primary cultures of neural cells is a good experimental model for the study of CNS infections by Rocio flavivirus. ROCV efficiently infected the primary cultured neural cells leading to cytopathic changes from the 2nd day a.i., when it detected the higher viral titer. The ROCV-infected primary culture survived up to 7 days a.i. and quantification of viral load showed a viral replication kinetics compatible with cell death kinetics of culture infected by ROCV. During the first five days a.i. of the primary culture, there was reduction of IFN-α gene expression, IFN-β, IFN-γ and IL-1β, there was no change in TNF-α expression and there was an increase in TGF-β expression in the 1st, 3rd and 5th day a.i.. The findings of this study suggest that ROCV has the ability to downregulate modulators cytokines of antiviral and inflammatory immune responses and, in this experimental model, immunoregulation exerted by TGF-β predominates over the modulation of inflammatory and antiviral immune responses, larger studies are needed to elucidate immunopathology of CNS infection by ROCV.