The enteric nervous system regulates autonomously from the central nervous system all the reflex pathways that control blood flow, motility, water and electrolyte transport and acid secretion. The ability of the gut to function in isolation is one of the most intriguing phenomenons in neurogastroenterology. This requires coding of sensory stimuli by cells in the gut wall. Enteric neurons are prominent candidates to relay mechanosensitivity. Surprisingly, the identity of mechanosensitive neurons in the enteric nervous system as well as the appropriate stimulus modality is unknown despite the evidence that enteric neurons respond to sustained distension. Objectives: The aim of our study was to record from mechanosensitive neurons using physiological stimulus modalities. Identification of sensory neurons is of central importance to understand sensory transmission under normal conditions and in gut diseases associated with sensorimotor dysfunctions, such as Irritable Bowel Syndrome. Only then it will be possible to identify novel targets that help to normalise sensory functions. Methods: We used guinea-pig ileum myenteric plexus preparations and recorded responses of all neurons in a given ganglion with a fast neuroimaging technique based on voltage sensitive dyes. To evoke a mechanical response we used two different kinds of stimuli: firstly we applied a local mechanical distortion of the ganglion surface with von Frey hair. Secondarily we mimic the ganglia deformation during physiological movements of myenteric ganglia in a freely contracting ileal preparation. We were able to reliably and reproducibly mimic this distortion by intraganglionic injections of small volumes of oxygenated and buffered Krebs solution using stimulus parameters that correspond to single contractions. We also performed in every ganglion tested, electrical stimulations to evoke fast excitatory postsynaptic potentials. Immunohistochemistry reactions were done with antibodies against Calbindin and NeuN, considered markers for sensory neurons. Results: Recordings were performed in 46 ganglia from 31 guinea pigs. In every ganglion tested we found from 1 to 21 (from 3% to 62%) responding cells with a median value of 7 (24% of the total number of neurons). The response consisted of an almost instantaneous spike discharge that showed adaptation. The median value of the action potential frequency in the responding neurons was 2.0 Hz, with a recording time of 1255 ms. The spike discharge lasted for 302 ± 231 ms and occurred only during the initial deformation phase. During sustained deformation no spike discharge was observed. The response was reproducible and was a direct activation of the enteric neurons since it remained after synaptic blockade with hexamethonium or ω-conotoxin and after long time perfusion with capsaicin. Muscle tone appears not to be required for activation of mechanosensory neurons. Mechanosensory neurons showed a response to mechanical stimulation related to the stimulus strength. All mechanosensory neurons received fast synaptic inputs. There was no correlation between mechanosensitivity and Calbindin-IR and NeuN-IR (44% of mechanosensitive neurones Calb-IR-/NeuN-IR-). Conclusions: We identified mechanosensitive neurons in the myenteric plexus of the guinea pig ileum which responded to brief deformation. These cells appear to be rapidly accommodating neurons which respond to dynamic change. All mechanosensitive neurons received fast synaptic input suggesting that their activity can be highly modulated by other neurons and hence there is a low stimulus fidelity which allows adjusting the gain in a sensory network. Mechanosensitivity appears to be a common feature of many enteric neurons belonging to different functional classes. This supports the existence of multifunctional enteric neurons which may fulfil sensory, integrative and motor functions.

L’osteoartrite (OA) rappresenta un gruppo di patologie a carico delle articolazioni che si stima colpisca più del 20% dei cani con età superiore a un anno. Si tratta di una condizione dove entrano in gioco fattori biomeccanici e biochimici, che si esprime clinicamente con zoppia e dolore. Le ricerche effettuate negli ultimi decenni hanno dimostrato il coinvolgimento dell’innervazione nocicettiva e simpatica nell’insorgenza e nel mantenimento del dolore e dell’infiammazione che caratterizzano l’OA. In questa, infatti, svolgono un ruolo cruciale i neuropeptidi, quali la sostanza P (SP) ed il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP), ed i neuromediatori simpatici liberati alla periferia rispettivamente dalle fibre nocicettive e dalle fibre simpatiche postgangliari. Col presente lavoro ci si è posti l’obiettivo di definire il tipo ed il numero di fibre nervose che innervano l’articolazione della spalla e del ginocchio di cane in soggetti esenti da patologia articolare ed affetti da osteoartrite. Campioni di legamenti e capsula articolare della spalla e della parte craniolaterale della capsula articolare del ginocchio sono stati sottoposto a reazione di doppia immunofluorescenza indiretta volta alla identificazione del numero complessivo di fibre nervose presenti e della percentuale di fibre SP, CGRP e simpatiche positive. I risultati testimoniano come in corso di OA nel cane venga ad alterarsi l’equilibrio tra innervazione sensitiva e simpatica. Infatti, lo studio quantitativo ha evidenziato che nei soggetti affetti da OA si assiste ad un incremento della percentuale di fibre SP positive e ad un decremento di quelle simpatiche. Si ritiene che l’integrità di questi due tipi d’innervazione sia necessaria per l’omeostasi tissutale e che un aumento delle fibre nocicettive e una riduzione di quelle simpatiche abbia un effetto proinfiammatorio e iperalgesico. È stata inoltre riscontrata una differente densità di fibre nervose a seconda del tipo di patologia considerata.

The ingestion of a meal evokes a series of digestive processes, which consist of the essential functions of the digestive system: food transport, secretory activity, absorption of nutrients and the expulsion of undigested residues do not absorbed. The gastrointestinal chemosensitivity is characterized by cellular elements of the endocrine gastrointestinal mucosa and nerve fibers, in particular of vagal nature. A wide range of mediators endocrine and/or paracrine can be released from various endocrine cells in response to nutrients in the diet. These hormones, in addition to their direct activity, act through specific receptors activating some of the most important functions in the control of energy intake and energy homeostasis in the body. For integration of this complex system of control of gastrointestinal chemosensitivity, recent evidence demonstrates the presence of taste receptors (TR) belonging to the family of G proteins coupled receptor expressed in the mucosa of the gastrointestinal tract of different mammals and human. This thesis is divided into several research projects that have been conceived in order to clarify the relationship between TR and nutrients. To define this relationship I have used various scientific approaches, which have gone on to evaluate changes in signal molecules of TR, in particular of the α-transducin in the fasting state and after refeeding with standard diet in the gastrointestinal tract of the pig, the mapping of the same molecule signal in the gastrointestinal tract of fish (Dicentrarchus labrax), the signaling pathway of bitter TR in the STC-1 endocrine cell line and finally the involvement of bitter TR in particular of T2R38 in patients with an excessive caloric intake. The results showed how there is a close correlation between nutrients, TR and hormonal release and how they are useful both in taste perception but also likely to be involved in chronic diseases such as obesity. / L’ingestione di un pasto evoca una serie di processi digestivi che consistono nelle funzioni essenziali dell’apparato digerente, trasporto degli alimenti, attività secretiva, assorbimento dei nutrienti digeriti e l’espulsione dei residui non assorbiti. La gastrointestinal chemosensitivity è caratterizzata da elementi cellulari endocrini della mucosa gastroenterica e da fibre nervose, soprattutto di natura vagale. Una ampia gamma di mediatori endocrini e/o paracrini possono essere rilasciati da varie cellule endocrine in risposta a nutrienti introdotti con la dieta. Tali ormoni, oltre alla loro attività diretta, agiscono attraverso recettori specifici attivando azioni di assoluta importanza nel controllo di varie funzioni tra cui l’introito calorico e l’omeostasi energetica dell’organismo. Ad integrazione di questo complesso sistema di controllo della chemosensitività gastrointestinale, recenti evidenze dimostrano la presenza di recettori del gusto (o taste receptors, TR) appartenenti alla famiglia dei recettori correlati alle proteine G espressi a livello della mucosa del tratto gastrointestinale di diversi mammiferi e dell’uomo. La presente ricerca, suddivisa in diversi progetti di ricerca, è stata concepita al fine di chiarire il rapporto tra TR e nutrienti. Per definire questo rapporto sono stati usati diversi approcci scientifici, che sono andati a valutare le variazioni delle molecole segnale dei TR in particolare dell’α-transducina in condizioni di digiuno e a seguito di rialimentazione standard nel tratto gastrointestinale di suino, la mappatura della stessa molecola segnale nel tratto gastrointestinale di pesce (Dicentrarchus Labrax), il signaling pathway dei bitter TR in colture cellulari endocrine STC-1 ed infine il coinvolgimento dei bitter TR, in particolare del T2R38 in pazienti con un eccessivo introito calorico. I risultati hanno evidenziato come ci sia una stretta correlazione tra nutrienti, TR e rilascio ormonale e come questi siano coinvolti non solo nella percezione del gusto propriamente detto ma probabilmente anche in patologie croniche come l’obesità.

Il trigono della vescica urinaria (UBT) è un'area limitata attraverso la quale penetrano nella vescica la maggior parte dei vasi e fibre e in cui le fibre nervose e neuroni intramurali sono più concentrati. Mediante l’utilizzo combinato di un tracciante retrogrado(FB) e dell’immunoistochimica sono stati valutati il fenotipo e l’area del soma dei neuroni dei gangli spinali (DRG), dei neuroni post-gangliari, il fenotipo dei gangli della catena simpatica (STG) e i gangli mesenterici caudali (CMG) innervanti l’UBT. - Caratterizzazione dei neuroni dei DRG con: peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP)(30±3%, 29±3%, rispettivamente), sostanza P(SP)(26±8%, 27±12%), ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS)(21±4%; 26±7%), neurofilamento 200kDa (NF200)(75±14%, 81±7% ) , transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%, 43±6%) e isolectina-B4-positivi (IB4) (56±6%;43±10%). I neuroni sensoriali, distribuiti da L2 a Ca1 (DRG), hanno presentato una localizzazione segmentale, mostrando maggior densità nei DRG L4-L5 e S2-S4. I neuroni sensoriali lombari sono risultati significativamente più grandi di quelle sacrali (1.112±624μm2 vs716±421μm2). Complessivamente, questi dati indicano che le vie lombari e sacrali probabilmente svolgono ruoli diversi nella trasmissione sensitiva del trigono della vescica urinaria. -I neuroni FB+ della STG e dei CMG sono risultati immunoreattivi per la tirosina idrossilasi (TH)(66±10,1%, 53±8,2%, rispettivamente), la dopamina beta-idrossilasi (DβH)(62±6,2%, 52±6,2%), neuropeptideY (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP(24±3%, 22±3%), SP(22±2%; 38±8%), polipeptide intestinale vasoattivo (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS(15±2%; 33±8%), trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAChT)(15±2%; 35±5%), leu-encefalina (LENK)(14±7%; 26±9%), e somatostatina (SOM)(12±3%;32±7%).Il numero medio di neuroni FB+ (1845,1±259,3) era nella STG in L1-S3, con i pirenofori più piccoli (465,6±82.7μm2). Un gran numero (4287,5±1450,6) di neuroni FB+ di piccole dimensioni (476,1±103,9μm2) sono stati localizzati lungo il margine dei CMG. Il maggior numero (4793,3±1990,8) di neuroni FB + è stato osservato nel plesso pelvico, dove i neuroni marcati erano raggruppati in micro-gangli e con pirenoforo ancora più piccolo (374,9±85,4 μm2). / The urinary bladder trigone (UBT) is a limited area through which the majority of vessels and nerve fibers penetrate into the urinary bladder and where nerve fibers and intramural neurons are more concentrated. The phenotype and soma cross-sectional area of dorsal root ganglion (DRG) neurons, the extramural post-ganglionic autonomic neurons, the phenotype of sympathetic trunk ganglia (STG) neurons and caudal mesenteric ganglia (CMG) neurons innervating the porcine UBT were evaluated by coupling retrograde tracer technique and immunohistochemistry. -Porcine lumbosacral DRG neurons were characterized neurochemically: calcitonin gene-related peptide (CGRP)(30±3%; 29±3%, respectively), substance P (SP)(26±8%; 27±12%), neuronal nitric oxide synthase (nNOS)(21±4% and; 26±7%), neurofilament200kDa (NF200)(75±14%; 81±7%), and transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%; 43±6%), and labeled for isolectin-B4 (IB4)(56±6%; 43±10%). UBT sensory neurons, which were distributed from L2 to Ca1 DRG, had a segmental localization, showing their highest density in L4–L5 and S2–S4 DRG. The lumbar UBT sensory neurons were significantly larger than sacral ones (1,112±624µm2 vs. 716±421µm2). Taken together, these data indicate that the lumbar and sacral pathways probably play different roles in sensory transmission from the UBT. -STG and CMG FB+ neurons were IR for tyrosine hydroxylase (TH)(66±10.1%; 52.7±8.2%, respectively), dopamine beta-hydroxylase (DβH)(62±6.2%; 52±6.2%), neuropeptide Y (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP (24±3%; 22±3%), SP (22±2%; 38±8%), vasoactive intestinal polypeptide (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS (15±2%; 33±8%), vesicular acetylcholine transporter (VAChT)(15±2%; 35±5%), leuenkephalin (LENK)(14±7%; 26±9%), and somatostatin (SOM)(12±3%; 32±7%). A mean number of 1845.1±259.3 FB+ neurons were localized in the L1-S3 STG, which appeared as small pericarya (465.6±82.7µm2). A large number (4287.5±1450.6) of small (476.1±103.9µm2) FB+ neurons were localized mainly along a border of both CMG. The largest number (4793.3±1990.8) of FB+ neurons was observed in the pelvic plexus (PP), where labeled neurons were often clustered within different microganglia and had smaller soma cross-sectional area (374.9±85.4 µm2).