La prima parte del nostro studio riguarda la tecnica LAMP (Loop-mediated isothermal amplification), una tecnica di amplificazione isotermica recentemente inventata (Notomi et al., 2000). Essa presenta notevoli vantaggi rispetto alle tradizionali PCR: non necessita di strumentazioni sofisticate come i termociclatori, può essere eseguita da personale non specializzato, è una tecnica altamente sensibile e specifica ed è molto tollerante agli inibitori. Tutte queste caratteristiche fanno sì che essa possa essere utilizzata al di fuori dei laboratori diagnostici, come POCT (Point of care testing), con il vantaggio di non dover gestire la spedizione del campione e di avere in tempi molto brevi risultati paragonabili a quelli ottenuti con la tradizionale PCR. Sono state prese in considerazione malattie infettive sostenute da batteri che richiedono tempi molto lunghi per la coltivazione o che non sono addirittura coltivabili. Sono stati disegnati dei saggi per la diagnosi di patologie virali che necessitano di diagnosi tempestiva. Altri test messi a punto riguardano malattie genetiche del cane e due batteri d’interesse agro-alimentare. Tutte le prove sono state condotte con tecnica real-time per diminuire il rischio di cross-contaminazione pur riuscendo a comprendere in maniera approfondita l’andamento delle reazioni. Infine è stato messo a punto un metodo di visualizzazione colorimetrico utilizzabile con tutti i saggi messi a punto, che svincola completamente la reazione LAMP dall’esecuzione in un laboratorio specializzato. Il secondo capitolo riguarda lo studio dal punto di vista molecolare di un soggetto che presenza totale assenza di attività mieloperossidasica all’analisi di citochimica automatica (ADVIA® 2120 Hematology System). Lo studio è stato condotto attraverso amplificazione e confronto dei prodotti di PCR ottenuti sul soggetto patologico e su due soggetti con fenotipo wild-type. Si è poi provveduto al sequenziamento dei prodotti di PCR su sequenziatore automatico al fine di ricercare la mutazione responsabile della carenza di MPO nel soggetto indicato. / The first part of the present study concerns the LAMP technique (Loop-Mediated Isothermal Amplification), an isothermal amplification technique recently developed (Notomi et al., 2000). LAMP has many advantages over traditional PCR: it doesn’t require sophisticated instruments like thermal cyclers, it can be performed by unskilled staff, it is a highly sensitive and specific technique and it is very tolerant to inhibitors. All these characteristics make it suitable to be used outside diagnostic laboratories, as POCT (Point-of-care testing), with the advantage of not having to send the sample and obtaining results as accurate as PCR tests and in very short times. We designed and optimized assays to detect bacteria that require a very long time for cultivation or that are not even cultivable. We drew assays for the diagnosis of viral diseases that require to be diagnosed as soon as possible. We developed a test to assess two genetic diseases of the dog and two food contaminating bacteria. All tests were carried out using real-time technique to decrease the risk of cross-contamination. Finally, we developed a colorimetric method for showing results which can be applied to all of the assays we optimized. The second section presents the molecular study of a subject who had myeloperoxidase deficiency at the automated cytochemistry analysis (ADVIA ® 2120 Hematology System). The study was conducted through amplification and comparison of the PCR products obtained from the pathological subject and on two subjects with wild-type phenotype. The products were sequenced using an automated sequencer in order to find the responsible mutation for the MPO deficiency in the indicated subject.

Disorders of the somatosensory system causing neuropathic pain (NP) are common in people. In small animals medicine, this condition remains underestimated probably due to the lack of standardized assessment methods and studies focused on the description of structures playing a key role in developing and maintaining neuropathic pain, such as dorsal root ganglia (DRG). Hence, the aims of the present research project, structured in three different studies, were: a) investigate the possible effects of the reduction in radicular blood flow on the vascular density, ganglionic and endoneurial ischemia and shift in neuronal metabolism, in fifteen L7-DRG from a total of eight dogs suffering from painful compressed spinal L7 nerve roots (NRs) and DRG; b) perform a preliminary characterization of the expression of substance P, calcitonin gene-related peptide, calbindin D-28k, neuronal nitric oxide synthase and the colocalization of those molecules in lumbosacral DRG neurons of three neurologically normal dogs; c) Investigate the prevalence, risk factors and owners’ perception of their pets quality of life of the Phantom Complex (PC) in a client-owned population of 107 dogs with limb amputation through an online survey. Main results were: a) Our findings highlight a significant neuronal distress in compressed DRG. Despite the similarity of vascular density between controls and compressed L7-DRG, we found a significant increased in neuronal immunoreactivity for hypoxia-related markers and for markers related to glycolytic cellular metabolism. b) The wide variability of CGRP-, SP-, CALB-, and nNOS-immunoreactivity among different species was confirmed. Further studies are required in order to better define the characterization of those markers in canine DRG. c) Our study demonstrates for the first time the presence of PC.Significant risk factors associated with the frequency of post-amputation pain episodes are duration of pain before amputation and time between diagnosis and amputation.

Negli ultimi anni si è assistito ad un miglioramento della qualità di vita dei piccoli animali che, oltre ad aumentarne l'aspettativa di vita, ha determinato un aumento della frequenza di patologie associate all'età medio-avanzata, quali le patologie renali croniche. Il presente studio si fonda sulla necessità, sempre più sentita nella pratica clinica veterinaria, di poter fornire al proprietario del paziente affetto da CKD, una serie di parametri che, oltre a fungere da target terapeutico, possano aiutare a comprenderne la prognosi. Lo studio ha valutato una popolazione di cani affetti da CKD e ne ha seguito o ricostruito il follow-up, per tutto il periodo di sopravvivenza fino al momento dell’exitus. Di tali soggetti sono stati raccolti dati relativi ad anamnesi, esame clinico, misurazione della pressione arteriosa, diagnostica per immagini, esami ematochimici, analisi delle urine ed eventuale esame istologico renale. È stato possibile individuare alcuni importanti fattori prognostici per la sopravvivenza in pazienti con CKD. Oltre a fattori ben noti in letteratura, come ad esempio elevati valori di creatinina e fosforo, o la presenza di proteinuria, è stato possibile anche evidenziare il ruolo prognostico negativo di alcuni parametri meno noti, ed in particolare delle proteine di fase acuta positive e negative, e del rapporto albumina/globuline. Una possibile spiegazione del valore prognostico di tali parametri risiede nel ruolo prognostico negativo dell’infiammazione nel paziente con CKD: tale ruolo è stato suggerito e dimostrato nell’uomo e avrebbe alla base numerosi possibili meccanismi (sviluppo di anemia, complicazioni gastroenteriche, neoplasie, etc.), ma dati analoghi sono mancanti in medicina veterinaria. Una seconda possibile spiegazione risiede nel fatto che potenzialmente i livelli delle proteine di fase acuta possono essere influenzati dalla presenza di proteinuria nel paziente con CKD e di conseguenza potrebbero essere una conferma di come la proteinuria influenzi negativamente l'outcome. / In recent years there has been an improvement in the quality of life of small animals. In addition of increasing life expectancy, this has led to an increase in the frequency of diseases associated with elderly, such as chronic kidney disease. The present study is based on the need, in the veterinary practice, to be able to provide the owner of a patient with CKD some parameters which can help to understand the prognosis, besides being useful as a therapeutic target. The study evaluated a population of dogs with CKD and followed these dogs or rebuilt the follow-up, until the exitus. We collected data on medical history, clinical examination, blood pressure measurement, diagnostic imaging, blood tests, urinalysis and, when possible, renal histology. It was possible to identify important prognostic factors for survival in patients with CKD. The prognostic role of high levels of creatinine and phosphorus, or the presence of proteinuria is well known in the literature. It was also possible to emphasize the negative prognostic role of some less known parameters, such as acute phase proteins and albumin to globulin ratio. One possible explanation of the prognostic value of these parameters lies in the negative prognostic role of inflammation in patients with CKD: this role has been suggested and demonstrated in humans and has many possible underlying mechanisms (development of anemia, gastrointestinal complications, cancer, etc.), but similar data are missing in veterinary medicine. A second possible explanation lies in the fact that the levels of acute phase proteins may be influenced by the presence of proteinuria in the patient with CKD and therefore may be a confirmation of how proteinuria negatively affects the outcome.

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