Physicians frequently face challenges in predicting which bacterial subpopulations are likely to cause severe infections. A more accurate prediction of virulence would improve diagnostics and limit the extent of antibiotic resistance. Nowadays, bacterial pathogens can be typed with high accuracy with advanced genotyping technologies. However, effective translation of bacterial genotyping data into assessments of clinical risk remains largely unexplored. The discovery of unknown virulence genes is another key determinant of successful prediction of infectious disease outcomes. The trial-and-error method for virulence gene discovery is time-consuming and resource-intensive. Selecting candidate genes with higher precision can thus reduce the number of futile trials. Several in silico candidate gene prioritisation (CGP) methods have been proposed to aid the search for genes responsible for inherited diseases in human. It remains uninvestigated as to how the CGP concept can assist with virulence gene discovery in bacterial pathogens. The main contribution of this thesis is to demonstrate the value of translational bioinformatics methods to address challenges in virulence prediction and virulence gene discovery. This thesis studied an important perinatal bacterial pathogen, group B streptococcus (GBS), the leading cause of neonatal sepsis and meningitis in developed countries. While several antibiotic prophylactic programs have successfully reduced the number of early-onset neonatal diseases (infections that occur within 7 days of life), the prevalence of late-onset infections (infections that occur between 7??30 days of life) remained constant. In addition, the widespread use of intrapartum prophylactic antibiotics may introduce undue risk of penicillin allergy and may trigger the development of antibiotic-resistant microorganisms. To minimising such potential harm, a more targeted approach of antibiotic use is required. Distinguish virulent GBS strains from colonising counterparts thus lays the cornerstone of achieving the goal of tailored therapy. There are three aims of this thesis: 1. Prediction of virulence by analysis of bacterial genotype data: To identify markers that may be associated with GBS virulence, statistical analysis was performed on GBS genotype data consisting of 780 invasive and 132 colonising S. agalactiae isolates. From a panel of 18 molecular markers studied, only alp3 gene (which encodes a surface protein antigen commonly associated with serotype V) showed an increased association with invasive diseases (OR=2.93, p=0.0003, Fisher??s exact test). Molecular serotype II (OR=10.0, p=0.0007) was found to have a significant association with early-onset neonatal disease when compared with late-onset diseases. To investigate whether clinical outcomes can be predicted by the panel of genotype markers, logistic regression and machine learning algorithms were applied to distinguish invasive isolates from colonising isolates. Nevertheless, the predictive analysis only yielded weak predictive power (area under ROC curve, AUC: 0.56??0.71, stratified 10-fold cross-validation). It was concluded that a definitive predictive relationship between the molecular markers and clinical outcomes may be lacking, and more discriminative markers of GBS virulence are needed to be investigated. 2. Development of two computational CGP methods to assist with functional discovery of prokaryotic genes: Two in silico CGP methods were developed based on comparative genomics: statistical CGP exploits the differences in gene frequency against phenotypic groups, while inductive CGP applies supervised machine learning to identify genes with similar occurrence patterns across a range of bacterial genomes. Three rediscovery experiments were carried out to evaluate the CGP methods: a) Rediscovery of peptidoglycan genes was attempted with 417 published bacterial genome sequences. Both CGP methods achieved their best AUC >0.911 in Escherichia coli K-12 and >0.978 Streptococcus agalactiae 2603 (SA-2603) genomes, with an average improvement in precision of >3.2-fold and a maximum of >27-fold using statistical CGP. A median AUC of >0.95 could still be achieved with as few as 10 genome examples in each group in the rediscovery of the peptidoglycan metabolism genes. b) A maximum of 109-fold improvement in precision was achieved in the rediscovery of anaerobic fermentation genes. c) In the rediscovery experiment with genes of 31 metabolic pathways in SA-2603, 14 pathways achieved an AUC >0.9 and 28 pathways achieved AUC >0.8 with the best inductive CGP algorithms. The results from the rediscovery experiments demonstrated that the two CGP methods can assist with the study of functionally uncategorised genomic regions and the discovery of bacterial gene-function relationships. 3. Application of the CGP methods to discover GBS virulence genes: Both statistical and inductive CGP were applied to assist with the discovery of unknown GBS virulence factors. Among a list of hypothetical protein genes, several highly-ranked genes were plausibly involved in molecular mechanisms in GBS pathogenesis, including several genes encoding family 8 glycosyltransferase, family 1 and family 2 glycosyltransferase, multiple adhesins, streptococcal neuraminidase, staphylokinase, and other factors that may have roles in contributing to GBS virulence. Such genes may be candidates for further biological validation. In addition, the co-occurrence of these genes with currently known virulence factors suggested that the virulence mechanisms of GBS in causing perinatal diseases are multifactorial. The procedure demonstrated in this prioritisation task should assist with the discovery of virulence genes in other pathogenic bacteria.

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2007. / Full text release at OhioLINK's ETD Center delayed at author's request

L'îlot génomique pks code une machinerie de biosynthèse complexe synthétisant la colibactine, une génotoxine produite par certaines souches de Escherichia coli. Cette génotoxine induit des cassures double-brin de l'ADN sur les cellules eucaryotes in vitro et in vivo. La colibactine n'est pas une protéine, mais un métabolite secondaire de type polycétide/peptide non-ribosomal (PK/NRP). Des résultats préliminaires de l'équipe semblaient indiquer que certains gènes du core genome de E. coli seraient également impliqués dans la production de la colibactine. L'objectif de cette thèse était d'identifier les gènes non-essentiels de E. coli situés hors de l'îlot génomique pks impliqués dans la synthèse de colibactine, en construisant une banque de mutants par insertion de transposons. Ce criblage a permis d'identifier 29 gènes candidats, mais deux groupes de gènes ont été particulièrement étudiés dans la suite du projet : trois gènes codants des protéines chaperons, et trois gènes codant des enzymes impliquées dans le métabolisme des polyamines. Le premier projet a permis de montrer que la protéine chaperon HtpG (ou Hsp90Ec), homologue bactérien de la protéine de choc thermique eucaryote Hsp90, est requise pour la production de colibactine, mais aussi de yersiniabactine, un sidérophore (ou système bactérien de captation du fer) appartenant à la même famille chimique que la colibactine. De plus, la protéase ClpQ intervient de concert avec Hsp90Ec dans la production de colibactine et de yersiniabactine. Ces résultats confirment ainsi l'interconnexion entre la synthèse des deux facteurs de virulence de E. coli, la colibactine et la yersiniabactine. Enfin, l'analyse des effets de la mutation du gène htpG au cours d'une infection systémique chez l'animal, dans des modèles de sepsis et de méningite néonatale chez les rongeurs, démontre le rôle de la protéine de réponse au stress Hsp90Ec dans la virulence de E. coli. Le second projet a révélé que les polyamines sont impliquées dans la production de colibactine. L'étude du métabolisme des polyamines par une approche de microbiologie moléculaire a démontré que la spermidine est la polyamine nécessaire à la production de colibactine. Les résultats préliminaires de ce projet indiquent que la spermidine participerait à la régulation de l'expression de certains gènes de l'îlot génomique pks, et de fait modulerait la biosynthèse de colibactine. Des études complémentaires sont en cours pour élucider les mécanismes impliqués. Les résultats de cette thèse sont une illustration parfaite de l'intégration symbiotique d'un élément génétique mobile acquis au cours de l'évolution au sein du chromosome bactérien, grâce à plusieurs connexions bilatérales permettant la production de facteurs de virulence par E. coli. / The pks genomic island codes a complex biosynthetic assembly line that synthetizes the colibactin, a genotoxin produced by some strains of Escherichia coli. This genotoxin generates DNA double-strand breaks in eukaryotic cells both in vitro and in vivo. Colibactin is not a protein, but a secondary metabolite belonging to the chemical family of hybrid polyketide/nonribosomal peptide compounds. Preliminary results from our research team suggested that certain genes of the E. coli core genome (i.e. genes present in all strains of the species) could also be involved in the colibactin production. The main goal of this thesis was to identify non-essential E. coli genes located outside the pks island that are required for colibactin biosynthesis, with the screening of a transposon mutant library. This revealed 29 potential candidate genes, but the project focused specifically on two groups of genes: three genes encoding chaperone proteins, and three genes encoding enzymes involved in polyamines metabolism. The first project highlighted the role of the molecular chaperone HtpG (or Hsp90Ec), the bacterial homolog of eukaryotic heat shock protein 90, in the production of colibactin, but also yersiniabactin, a siderophore (i.e. a bacterial iron uptake system) that belongs to the same chemical family as colibactin. Furthermore, the ClpQ protease was involved in colibactin and yersiniabactin production in combination with Hsp90Ec. These results confirmed the interplay between the biosynthesis of two E. coli virulence factors, colibactin and yersiniabactin. Finally, analysis of the effects of htpG disruption during systemic infection in animals, using rodent models of sepsis and neonatal meningitis, demonstrated the role of the stress-responsive molecular chaperone Hsp90Ec in E. coli virulence. The second project revealed the involvement of polyamines in the biosynthesis of colibactin. A molecular microbiology approach demonstrated that spermidine was the polyamine required for colibactin production. Preliminary results suggested that spermidine could regulate the expression of some pks island genes, and therefore could modulate colibactin production. Further experiments are in progress to elucidate the molecular mechanisms involved in this regulation. Together, the results of this thesis perfectly illustrate the symbiotic integration of a mobile genetic element acquired during evolution into the bacterial chromosome, through several crosstalks allowing the production of virulence factors in E. coli.

Salmonella est la deuxième cause de zoonoses humaines dans l’Union Européenne et représente un enjeu majeur pour la filière porcine. Les sérovars, S. Typhimurium, S. Derby et le variant monophasique de S. Typhimurium sont très prévalents chez le porc et également chez les humains. Les objectifs de ces travaux étaient d’établir la dynamique d’infection chez le porc par Salmonella en condition d’élevage conventionnel et expérimental, d’évaluer le pouvoir colonisateur chez le porc et le pouvoir pathogène chez les humains des trois sérovars. En élevage conventionnel, le suivi sérologique des anticorps anti-Salmonella a permis d’évaluer l’âge moyen de séroconversion à 137 jours et d’identifier un « effet ferme » sur l’âge de séroconversion. Le premier essai en condition expérimentale a mis en évidence que les porcs inoculés avec le variant monophasique de S. Typhimurium excrétaient ce sérovar de façon continue dans les fèces. Aux dates d’autopsies 21, 49 ou 84 jours après inoculation, les salmonelles ont été retrouvées dans les différentes parties de l’intestin, dans les nœuds lymphatiques et à des niveaux très élevés dans les amygdales. Après passage dans le tractus digestif, des profils MLVA différents de celui de la souche inoculée ont été identifiés suggérant que le génome de la souche a évolué. Le deuxième essai visant à comparer le pouvoir colonisateur chez le porc des trois sérovars a montré que la dynamique d’excrétion et de colonisation était similaire quel que soit le sérovar. Cependant, la quantité excrétée était significativement différente ; plus élevée avec le variant monophasique par rapport à S.Typhimurium. Le pouvoir pathogène chez l’homme de 15 souches d’origine porcine appartenant aux 3 sérovars a été évalué in vivo sur un modèle insecte Galleria mellonella, et in vitro sur cellules Caco-2. Les souches se sont révélées être potentiellement virulentes. Sur Caco-2, le variant monophasique avait un pourcentage d’adhésion aux cellules le plus élevé et Derby le plus bas. Différents niveaux de virulence ont été observés entre souches d’un même sérovar. Ce travail a apporté des nouvelles connaissances sur la problématique Salmonella en filière porcine. / Salmonella is the second leading cause of human zoonoses in the European Union and represents a major challenge for the pork industry. Serovars S. Typhimurium, S. Derby and the monophasic variant of S. Typhimurium, implicated in human salmonellosis, are highly prevalent in pigs and also in human. The objectives of this research were to establish the infection dynamics in pigs by Salmonella under conventional and experimental rearing conditions, to evaluate pig colonization ability and pathogenicity in humans of the three serovars. In conventional farms, the serological monitoring of Salmonella antibodies allowed to evaluate the average age of seroconversion at 137 days and to identify a "farm effect" on the age of seroconversion. The first trial under experimental conditions revealed that pigs inoculated with the monophasic variant of S. Typhimurium excreted this serovar continuously in the feces. At autopsy dates 21, 49 or 84 days after inoculation, Salmonella were found in the different parts of the intestine, in the lymph nodes and at very high levels in the tonsils. After passage through the digestive tract, different MLVA profiles from that of the inoculated strain were identified suggesting that the genome of the strain has evolved. The second attempt to compare the colonizing ability in the pigs of the three serovars showed that the dynamics of excretion and colonization were similar regardless of the serovar. However, the amount excreted was significantly different: higher with the monophasic variant compared to S. Typhimurium. The pathogenicity in humans of 15 strains of porcine origin belonging to the 3 serovars was evaluated in vivo on an insect model Galleria mellonella, and in vitro on Caco-2 cells. The strains were found to be potentially virulent. On Caco-2, the monophasic variant had the highest cell adhesion percentage and Derby, the lowest. Different levels of virulence were observed between strains of the same serovar. This work brought new knowledge on the Salmonella issue in the pig sector.

Les problèmes de santé publique causés par des bactéries comme Mycobacterium tuberculosis et Salmonella enterica sont amplifiés par l’émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques, d’où la nécessité de mettre au point rapidement de nouvelles stratégies antimicrobiennes. La découverte récente de peptides membranaires bactériens qui ont la propriété de réguler des partenaires protéiques membranaires impliqués dans la virulence bactérienne permet d’envisager des stratégies « anti-virulence » innovantes.Mon travail a porté sur l’étude de deux peptides membranaires, KdpF et MgtR, chez M. bovis BCG et S. typhimurium, qui sont des pathogènes intracellulaires capable de survivre dans les macrophages. La surexpression de KdpF chez M. bovis BCG et de MgtR chez S. typhimurium entraîne une diminution de la survie bactérienne dans les macrophages et je me suis attachée à en comprendre la mécanistique et à étudier l’effet biologique de peptides KdpF et MgtR synthétiques.Ces travaux m’ont permis de mettre en évidence que les peptides KdpF endogène et synthétique augmentent la sensibilité des bactéries au stress azoté. Nous proposons que cela soit en lien avec la déstabilisation de la nitrate réductase. De plus et pour la première fois, j’ai démontré que le peptide synthétique KdpF est biologiquement actif et mime les propriétés anti-virulence du peptide endogène KdpF dans les macrophages.J’ai montré que le peptide synthétique MgtR réduit la survie intra-macrophagique de S. typhimurium, et j’ai identifié un peptide variant ayant une action encore plus efficace. Ces deux peptides entraînent une diminution du taux de plusieurs protéines de la membrane interne, dont certaines sont des facteurs de virulence reconnus.De plus, j’ai contribué à une étude visant à tester l’effet anti-virulence du peptide MgtR de Salmonella chez les mycobactéries. En utilisant un système hétérologue, j’ai montré que l’ajout du peptide synthétique MgtR peut empêcher la dimérisation de la protéine MgtC de M. tuberculosis et également favoriser sa déstabilisation.En conclusion, l’ensemble de mes résultats permet de mieux comprendre le mécanisme d’action des peptides membranaires KdpF et MgtR et montre que les peptides synthétiques KdpF et MgtR possèdent des propriétés anti-virulence prometteuses, point essentiel pour valider la pertinence de ces molécules dans le cadre de stratégies innovantes alternatives ou complémentaires aux antibiotiques. / The public health problems caused by bacteria such as Mycobacterium tuberculosis and Salmonella enterica are amplified by the emergence of multi-drug resistant strains, leading to the demand of new antimicrobial strategies. The recent discovery of bacterial membrane peptides that have regulatory effects on membrane protein involved in bacterial virulence makes it possible to envisage innovative "anti-virulence" strategies.My work was focused on the study of two membrane peptides, KdpF and MgtR, in M. bovis BCG and S. typhimurium respectively, which are intracellular pathogens capable of surviving in macrophages. Overexpression of KdpF in M. bovis BCG and MgtR in S. typhimurium, has already been reported to decrease bacterial survival in macrophages. Therefore, I focused on the study of mechanism and biological effect of synthetic KdpF and MgtR peptides.This work allowed me to conclude that endogenous and synthetic KdpF peptides increase the sensitivity of bacteria to nitrosative stress. I propose that this is related to the destabilization of the enzyme nitrate reductase. In addition and for the first time, I have demonstrated that the synthetic KdpF peptide is biologically active and mimics the anti-virulence properties of the endogenous KdpF peptide in macrophages.In the next part of my study, I have shown that the synthetic MgtR peptide reduces the intramacrophage survival of S. typhimurium and I have identified a variant peptide with even stronger action. These two peptides cause a decrease in the level of several proteins of the inner membrane, some of which are recognized as virulence factors.In addition to that, I tested the anti-virulence effect of Salmonella MgtR peptide in mycobacteria. Using a heterologous system, I have shown that the addition of the synthetic MgtR peptide can prevent the dimerization of M. tuberculosis MgtC protein and also promote its destabilization.In conclusion, all my results provide a better understanding of the mechanism of action of KdpF and MgtR membrane peptides and show that the synthetic peptides KdpF and MgtR have promising anti-virulence properties. This is an essential factor to validate the relevance of these molecules as part of innovative, alternative or complementary strategies to antibiotics.

Tick-borne encephalitis virus (strain Hypr) was serially subcultured in PS cells and tick cell line IRE/CTVM19, producing four different viral variants. Biological properties of these new variants were investigated in mouse model. Possible determinants of virulence were found by full-genome sequencing. The role of glycosylation for tick-borne encephalitis virus was evaluated.

Le traitement actuel de la grippe repose sur des antiviraux ciblant des protéines virales qui peuvent induire l'apparition de virus résistants. Pour limiter ce risque, des thérapeutiques alternatives sont développées qui ciblent des partenaires cellulaires indispensables au virus. Cette thèse s'inscrit dans cette recherche de nouveaux antiviraux ciblant des protéines cellulaires et dans l'étude des relations hôte-pathogène indispensable à leur mise au point. Nous proposons une méthode innovante pour l'identification d'antiviraux basée sur la signature transcriptionnelle cellulaire d'infection commune à 5 virus influenza de type A appartenant à des sous types différents (H1N1, H3N2, H5N1, H5N2 et H7N1). Huit molécules induisant un profil transcriptionnel inverse à celui de l'infection ont été sélectionnées dans la base de donnée Connectivity map et 7 molécules se sont révélées antivirales sur au moins un des virus testés in vitro. Cette étude est la première à montrer qu'une sélection basée sur le profil d'expression génique peut être utilisée pour identifier des antiviraux. Cette étude transcriptomique permet en outre de caractériser les réponses cellulaires spécifiques à différents sous-types viraux. Alors que le virus H1N1 modifie peu la transcription cellulaire, les virus H3N2, H5N1, H5N2 et H7N1 modulent l'expression de gènes impliqués dans les voies MAPK, NF-KB, IRF3 et p53. L'analyse de l'implication fonctionnelle des modifications spécifiques des voies de transduction cellulaire pourrait permettre de mieux comprendre la pathogenèse particulière de certaines souches virales / The current treatment of flu relies on antiviral drug targeting viral proteins that can induce the appearance of resistant virus. To limit this risk, alternative therapies are developed that target essential cellular partners of the virus. This thesis is part of this search for new therapeutic and of the study of host-pathogen interactions essential to their development. We proposed an innovative method for the identification of antiviral drugs based on the cell gene- expression profile associated with infection with five different influenza A virus strains belonging to different subtypes (H1N1, H3N2, H5N1, H5N2 and H7N1). Eight molecules inversing the infection signature were selected from the Connectivity Map database and 7 molecules inhibited viral growth on at least one of the viruses tested in vitro. This is the first study showing that gene expression- based screening can be used to identify antivirals. This transcriptomic study provides further characterization of strain specific cellular responses. While HlN1 virus changes slightly cellular transcription, H3N2, H5N1, H5N2 and H7N1 viruses modulate the expression of genes involved in MAPK, NF-kB, IRF3 and p53 pathways. Analysis of the functional involvement of specific modifications of cellular transduction pathways could help to better understand the pathogenesis of some particular viral strains

La contamination des zones littorales par des bactéries entériques potentiellement pathogènes pour l’Homme constitue un problème majeur pour la pérennité de certains usages tel que la conchyliculture. Ces bactéries provenant de rejets agricoles ou urbains peuvent atteindre les zones conchylicoles et être impliquées dans des toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Actuellement, très peu de données sont disponibles sur la présence et la diversité des bactéries entériques telles que les Escherichia coli (E. coli) pathogènes de type E. coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) et E.coli entéropathogènes (EPEC) dans les coquillages en France.La présence de ces E. coli pathogènes a été recherchée pendant deux ans, dans trois zones conchylicoles françaises et leurs bassins versants. Un total de 28 souches STEC et 89 souches EPEC différentes ont été isolées dans des coquillages, des eaux aux exutoires, le sédiment et l’eau de mer, représentant 1% de la totalité des souches E. coli isolées (n=12016). Ces souches isolées présentaient néanmoins une grande diversité. Elles étaient réparties au sein de 73 profils de virulence différents dont une souche STEC de sérotype O26 :H11 présentant 47 gènes de virulence isolée dans un lot de moule. Soixante-quinze pourcents des souches EPEC présentaient des gènes de virulence associés à des îlots de pathogénicités caractéristiques de souches pathogènes responsables d’infection grave chez l’Homme, révélant le potentiel pouvoir pathogène de certaines souches. Enfin, l’étude de la cinétique de contamination, décontamination d’huîtres au contact de souches STEC, n’a pas montré de différence comparée à un E. coli non STEC.Les travaux réalisés au cours de cette thèse sont à notre connaissance les premiers de ce genre. Ils ont permis de mettre en évidence la faible présence de STEC et de EPEC au niveau des zones conchylicoles françaises étudiées ainsi que le potentiel pouvoir pathogène de certaines souches. La faible prévalence des souches sur ces sites de catégorie B ou C (purification des coquillages avant commercialisation) reste néanmoins plutôt en faveur d’un risque faible de contamination dans les zones sélectionnées. Les résultats acquis au cours de cette thèse sont des éléments importants pour mieux appréhender le risque sanitaire potentiel lié aux STEC et aux EPEC en zone littorale. / The contamination of coastal areas by potentially pathogenic enteric bacteria is of concern for the sustainability of some uses, such as shellfish farming, recreational shellfish harvesting and bathing. The contamination of these environments may occur through the land-spreading of livestock wastes, animal feces deposited on pastures, wastewaters from slaughterhouses. The presence of these bacteria in coastal environment may present a potential risk to human health. In fact, shellfish-borne outbreaks may occur by the consumption of shellfish from contaminated areas. To date, few studies focusing on the presence and the diversity of enteric bacteria, such as pathogenic Escherichia coli (E. coli) more precisely, Shiga-toxin-producing E. coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) in coastal environments and shellfish have been reported.For this purpose, during a 2-year study, shellfish batches, freshwater, seawater, and surface sediment samples from three French selected shellfish-harvesting areas and their upstream catchments, were analyzed to evaluate the presence of STEC and EPEC strains. Twenty-eight STEC and 89 EPEC strains were isolated representing 1% of the total E. coli(n=12 016). The isolated STEC and EPEC strains belonged to a high diversity. One STEC strain isolated from a mussel batch, belonging to the serotype O26:H11 displayed 47 additional virulence genes. Seventy-five percent of EPEC strains displayed several virulence genes associated with pathogenicity islands specific to pathogenic E. coli involved in human infections.No difference in the kinetics of the contamination and depuration of oysters by STEC and non-STEC E. coli was found.To our knowledge, this study is the first to focus on the diversity of STEC and EPEC strains isolated from coastal environments. This study highlights the weak presence of STECs and EPECs in the French shellfish-harvesting areas studied and a potential pathogenicity of some strains. The low prevalence of STEC and EPEC strains in shellfish fromB- and C-categories (depuration of shellfish before commercialization), is rather in favor of a limited risk of contamination of shellfish in the studied areas. The results obtained during this study are important to better understand the health risk associated with STEC and EPEC in coastal areas.

Salmonella Typhimurium est un pathogène intracellulaire dont la virulence repose sur l'expression de protéines effectrices qui sont transportées dans les cellules hôtes infectées. Dans la cellule cette bactérie réside dans un compartiment appelé SCV (Salmonella-containing vacuole). Au cours de l'infection, la protéine effectrice SifA est transportée du cytosol bactérien à celui de la cellule infectée. Après sa translocation SifA est retrouvée à la surface de la SCV et des tubules. Cette protéine est constituée de deux domaines distincts. Le domaine N-terminal interagit avec la protéine hôte SKIP. Le domaine C-terminal a une structure similaire à d'autres protéines bactériennes possédant une activité d'échange de nucléotide guanine (GEF). Cependant on ignore si le domaine C-terminal contribue aux fonctions de SifA dans la virulence de Salmonella et, si c'est le cas, si il exerce une activité GEF sur une protéine de l'hôte. Nous avons utilisé un modèle de souris invalidée pour SKIP pour montrer que SKIP est un médiateur du rôle de SifA dans la virulence de Salmonella et que SifA à également un rôle qui est indépendant de son interaction avec SKIP. Ce dernier est porté par le domaine C-terminal de SifA. Nous avons montré que ce domaine de SifA se lie à la petite GTPase Arl8b, une protéine lysosomale. Le domaine C-terminal de SifA et Arl8b sont importants pour le recrutement de LAMP1 sur les SCVs et les tubules associés. L'utilisation d'une lignée cellulaire invalidée pour l'expression d'Arl8b a montré une prolifération réduite de Salmonella. Ces résultats nous permettent de proposer un modèle pour le rôle du domaine C-terminal de SifA dans la virulence de Salmonella. / The virulence of the intracellular pathogen Salmonella Typhimurium relies on the expression of bacterial effector proteins that are translocated into infected host cells. This bacterium resides and proliferates in a host-cell compartment named the Salmonel-la-containing vacuole (SCV). Following translocation in the infected host cells, the effector protein SifA localizes onto the SCV and SCV-associated membrane tubules. This protein is made of two distinct domains. The SifA N-terminal domain interacts with the host-cell protein SKIP. The SifA C-terminus has a fold similar to other bacterial effector proteins having a guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity. Indeed, SifA binds preferentially a GDP-bound form of RhoA but does not stimulate GDP disso-ciation. Therefore it remains unknown whether the SifA C-terminus contributes to the functions of SifA in Salmonella virulence and, if it does, whether it has a GEF activity towards a host protein. We used a model of SKIP knockout mice to show that SKIP mediates susceptibility to Salmonellosis and to establish that SifA also contributes to Salmonella virulence independently of its interaction with SKIP. We next identified that the SifA C-terminal domain supports this contribution. We have further showed that the SifA C-terminus binds the small GTPase Arl8b and that both SifA C-terminus and activated Arl8b are important for the recruitment of LAMP1 on SCVs and associated tubules. Using an Arl8b knock down cell line, we observed that the absence of Arl8b results in a reduced proliferation of wild-type Salmonella. Finally, we proposed a model for the role of the SifA C-terminus in Salmonella virulence.

Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs. / Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution.