L’histone variante H2A.Z, histone de la famille H2A est enrichie dans certaines régions non transcrites de la chromatine, telles que la chromatine péricentromérique, centromérique et télomérique. Elle existe sous la forme de deux isoformes, H2A.Z-1 et H2A.Z-2, qui diffèrent par seulement 3 acides aminés et sont codés par deux gènes distincts, H2afz et H2afv. L’histone H2A.Z apparait impliquée dans divers évènements cellulaires tels que la transcription, la réparation de l’ADN ainsi que la prolifération et la différenciation cellulaire. La fonction de H2A.Z a été, jusqu’ici, analysée surtout grâce à la culture cellulaire in-vitro. Peu d’informations sont disponibles concernant le rôle de H2A.Z in-vivo dans différents organes, reflétant le manque de modèles animaux permettant l’invalidation génique de H2A.Z. Nous avons créé un modèle de souris transgénique permettant de réaliser in-vivo le double knock-out conditionnel (KI/cKO) des gènes H2afz et H2afv de manière tissu-spécifique dans les kératinocytes de la peau. Ce modèle d’étude in-vivo est unique car le seul à ce jour permettant d’éliminer complètement l’expression de H2A.Z. L’histone variante est physiologiquement présente dans toutes les cellules wild-type. Si les deux gènes codant pour H2A.Z sont délétés, la concentration de l’histone diminue au fur et à mesure des mitoses successives et finit par disparaître.L’épiderme en constante prolifération (tissu mitotique) mais aussi en constante différenciation (tissu post-mitotique), ainsi que le follicule pileux où ces deux processus intervenent de manière cyclique lors de la formation du poil, constituent un excellent modèle afin de disséquer le rôle spécifique de H2A.Z dans les processus de prolifération et de différenciation.L’induction par le tamoxifène du transgène K14CreERT2 invalidant les gènes H2A.Z (H2afz et H2afv) dans les kératinocytes, a tout d’abord été réalisée chez la souris adulte âgée de 6-8 mois. Elle entraine progressivement la perte totale de l’histone variante H2A.Z dans les cellules d’amplification transitoire (TA) qui se multiplient activement : au niveau du follicule pileux en phase de croissance (anagène) et au niveau des cellules situées de place en place au niveau de l’assise basale de l’épiderme. Le blocage en phase G2/M de ces cellules, perturbe l’homéostasie de la peau et appelle en retour une migration des cellules souches du follicule pileux vers l’épiderme, entrainant un épaississement de l’épiderme et une alopécie dans la région ventrale thoracique.Lors de la mise en place de la peau embryonnaire la délétion des deux gènes H2afz et H2afv, par l’induction du transgène K14CreERT2 suite à l’injection de tamoxifène ou l’utilisation du transgène K5Cre dont l’activité est constitutive, entraine la perte progressive de l’histone H2A.Z dans toutes les cellules épidermiques et les cellules des bourgeons pileux, qui toutes ont un fort indice de prolifération. La perte de H2A.Z entrainant le blocage des cellules en phase G2/M, ces cellules se différencient et s’accumulent dans la couche cornée.En conclusion, les différents phénotypes développés après le knock-out de H2A.Z dans les kératinocytes chez l’adulte ainsi qu’au cours de l’embryogénèse de la peau, nous ont permis de montrer l’implication de H2A.Z dans la progression de la mitose, et par la même directement son implication dans la régulation de l’homéostasie de l’épiderme. / Histone variant H2A.Z replaces the canonical histone H2A and is particularly enriched at non-transcribed chromatin regions as pericentromeric, centromeric and telomeric. Histone variant H2A.Z exists in two isoforms H2A.Z-1 and H2A.Z-2 coded by 2 distinct genes, H2afz and H2afv, that differ only by 3 amino acids. H2A.Z seems to be involved in several cellular events as transcription, DNA repair as well as proliferation and cellular differentiation. The function of H2A.Z has been, until now, mostly studied by the in-vitro cell culture. Few data are available concerning the role of H2A.Z in-vivo, regarding different organs, reflecting the lack of animal models to follow the genetic invalidation of H2A.Z. Histone variant H2A.Z is present in wild-type cells and when the 2 genes coding for H2A.Z are deleted, its concentration decreases progressively with succeeding mitosis until it disappeared.We have created a new and unique transgenic mouse model enabling to achieve, in-vivo, a double conditional knock-out of H2afz and H2afv genes, in a specific tissue, the skin epidermis. Constantly proliferating (mitotic tissue) and differentiating (post-mitotic tissue), the epidermis and hair follicles are excellent models to address the role of H2A.Z in cell proliferation and differentiation.In adult 6-8 months mice, the induction of the transgene K14CreERT2 by tamoxifen invalidates H2A.Z genes (H2afz and H2afv) and leads to the progressive loss of H2A.Z in transient amplifying cells (TA) that actively proliferate: in growing hair follicles (anagen) and in epidermal basal layer. The blocking of cells in G2/M phase, affects skin homeostasis calling in return the migration of stem cells from the hair follicle and epidermis, resulting in further epidermis thickening and alopecia of ventral thoracic regions.During skin embryogenesis, the deletion of both H2A.Z genes, activating K14CreERT2 transgene by tamoxifen or by using the constitutively activated K5Cre transgene, leads to a progressive loss of histone variant H2A.Z in all epidermal cells and hair bud cells, which both have a high proliferation index. The loss of H2A.Z results in cell block in G2/M phase, leads to cell differentiation and finally a build-up of dead skin cells in corneum layer.To conclude skin phenotypes obtained H2A.Z knock-out in the adult or during skin embryogenesis, show that H2A.Z plays an essential role in mitosis and appears directly involved in the regulation of epidermis homeostasis.

Dans les cellules eucaryotes l'ADN nucléaire est organisé sous la forme de chromatine, dont l'unité de répétition est le nucleosome. En règle générale, la chromatine est considérée comme répressive pour les processus nécessitant un accès à l'ADN tels que la transcription, la réplication ou la réparation. Le nucléosome représente une forte barrière pour des protéines nécessitant l'accès à l'ADN. Pour surmonter cette barrière, la cellule a développé des méthodes variées, dont la plus importante semble être le remodelage des nucléosomes dépendant de l'ATP. Une propriété commune à tous ces facteurs de remodelage est leur capacité de repositionner les nucléosomes le long de l'ADN.<br /><br />Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme de déplacement des nucléosomes par RSC et SWI/SNF, deux facteurs de remodelage de levure bien caractérisés. Nous avons combiné des approches basées sur la visualisation à haute résolution, notamment la microscopie à force atomique (AFM) et la cryo-microscopie électronique, avec des approches nouvelles à pointe de la biochimie et de la biologie moléculaire. <br /><br />Nous avons montré que la mobilisation des nucléosomes par RSC ou SWI/SNF implique des espèces réactionnelles intermédiaires métastables dont l'existence et la structure étaient jusqu'alors inconnues. Ces particules nucléosomales, que nous avons nommé ‘remosomes', possèdent certaines propriétés structurales distinctes des nucléosomes canoniques. En particulier, les ‘remosomes' contiennent ~180 pb d'ADN associées à l'octamère d'histones au lieu de 147 pb pour les nucléosomes canoniques. En utilisant, l'empreinte à la DNase I nous avons montré que le ‘remosome' représente un ensemble de structures multiples caractérisées par un enroulement fortement perturbé de l'ADN sur l'octamère d'histones. Pour caractériser ces ‘remosomes' avec une grande précision, nous avons mis au point une nouvelle technique « one pot in gel assay » qui consiste à cartographier toutes les 10 pb l'accessibilité d'une enzyme de restriction au ‘remosome' fractionné. L'application de cette technique a révélé que le profil de l'accessibilité du ‘remosome' est très différent de celui du nucléosome. Alors que celui du nucléosome peut être extrapolé par une fonction de type hyperbolique, le profil du ‘remosome' est ajusté par une fonction parabolique. <br /><br />Nous avons voulu répondre à la question du mécanisme de l'inhibition de la mobilisation du nucléosome variant H2A.Bbd par SWI/SNF. En utilisant les techniques décrites plus haut sur des nucléosomes variants ou chimériques (contenant des délétions ou translocations de domaines d'histones) nous avons montré que le domaine d'accrochage (‘docking domain') de l'histone H2A est essentiel pour la mobilisation des nucléosomes. Nous avons aussi montré que l'incapacité du nucléosome à glisser est due à la génération d'états intermédiaires ‘remosomes erronés', distincts de ceux apparaissant dans le cas du nucléosome conventionnel.

Dans les cellules eucaryotes, la réponse aux lésions de l'ADN s'accompagne d'une réorganisation de la chromatine. Cette structure, associant l'ADN aux protéines histones, est porteuse de l'information épigénétique, qui définit l'identité cellulaire. Cependant, nos connaissances concernant les mécanismes impliqués dans la réorganisation de la chromatine dont l'intégrité structurale et fonctionnelle a été menacée par un stress génotoxique sont encore limitées, en particulier dans les cellules humaines. Au cours de ma thèse, je me suis donc intéressée à cette thématique en me concentrant sur l'étude de la dynamique des variants de l'histone H3 et de leurs chaperons associés après dommages UVC. En combinant une technologie innovante de suivi spécifique des histones parentales ou néo-synthétisées à des techniques de pointe d'induction de dommages locaux dans l'ADN, j'ai ainsi mis en évidence que le chaperon HIRA (Histone Regulator A) est recruté tôt aux sites de lésions où il stimule l'incorporation locale de nouveaux variants H3.3 et assure la reprise de la transcription après réparation des dommages UVC. Nous avons aussi démontré que les anciennes histones sont initialement redistribuées dans la chromatine autour des sites de lésions par un mécanisme faisant appel au facteur de détection des dommages DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). A plus long terme, des histones parentales " reviennent " dans les régions de chromatine en cours de réparation où elles se mélangent aux nouvelles histones incorporées. Le " retour " d'histones préexistantes contribuerait ainsi au maintien de l'intégrité de l'information épigénétique véhiculée par la chromatine avant stress génotoxique. / In eukaryotic cells, the DNA damage response involves a reorganization of chromatin structure. This structure, in which DNA is associated with histone proteins, conveys the epigenetic information, which is critical for cell identity. However, we are still far from understanding the mechanisms underlying chromatin dynamics in response to DNA damage, which challenges both the structural and functional integrity of chromatin architecture. During my PhD, I thus decided to explore this issue in human cells, by deciphering the dynamics of histone H3 variants and their dedicated chaperones in response to UVC lesions. By combining local UVC irradiation with an innovative technology that allows specific tracking of parental and newly synthesized histones, I revealed that the histone chaperone HIRA (Histone Regulator A) is recruited early to UVC-damaged chromatin regions, where it promotes local deposition of new histone H3.3 variant and facilitates transcription recovery upon repair completion. We also demonstrated that old H3 histones are initially redistributed around the damaged chromatin zone, this conservative redistribution requiring the UVC damage sensor DDB2 (DNA Damage Binding protein 2). Later in the repair process, most parental histones recover and mix with newly deposited histones in repairing chromatin regions. The recovery of pre-existing histones may contribute to preserve the integrity of the epigenetic information conveyed by chromatin before genotoxic stress.