Résumé confidentiel / Confidential abstract

Résumé confidentiel / Confidential abstract

La Sphingosine 1-phosphate (S1P) est un lipide bioactif qui joue un rôle majeur dans de nombreux processus tels que le développement vasculaire, la circulation des cellules immunitaires et la régulation de l’intégrité vasculaire. L’absence de S1P circulante engendre une augmentation constitutive de la perméabilité vasculaire ainsi qu’une sensibilité accrue à l’anaphylaxie systémique passive, cependant l’implication respective des différentes sources de la S1P au cours de ces processus, demeure méconnue. Ceci est plus particulièrement vrai pour les plaquettes qui constituent une réserve importante de S1P. La S1P d’origine plaquettaire ne contribue pas au pool de S1P plasmatique, il n’est libéré que lors de l’activation plaquettaire. Nous avons étudié le rôle de la S1P d’origine plaquettaire au sein des vaisseaux sanguins, au cours du développement embryonnaire et chez des souris adultes, en présence ou en absence d’autres sources de S1P circulante, notamment des globules rouges. Par délétion des gènes codant pour les sphingosine kinases 1&2 au sein des megakaryocytes, nous avons généré des souris dont les plaquettes sont incapables de synthétiser et donc de sécréter la S1P. Ces plaquettes sont par ailleurs incapables, in vitro, de promouvoir le maintien de la barrière endothéliale. Néanmoins, une déficience en S1P d’origine plaquettaire n’augmente pas le risque d’hémorragie au cours du développement embryonnaire, dans un contexte d’inflammation, d’irradiation, ou de traumatisme ; cela suggère que la S1P d’origine plaquettaire n’est pas indispensable au cours de ces processus. Cependant, nous avons découvert que la résistance au choc anaphylactique est compromise en l’absence de S1P d’origine plaquettaire. L’aspirine bloquant la sécrétion de S1P par les plaquettes, un traitement à l’aspirine induit également une sensibilisation au choc anaphylactique de façon similaire à celle observée dans le cas d’une déficience en S1P d’origine plaquettaire. Il semblerait que dans ce contexte, la S1P d’origine plaquettaire joue plutôt un rôle pour promouvoir le tonus vasculaire via S1P2, que de maintenir l’intégrité vasculaire. / Sphingosine 1-phosphate (S1P) is a bioactive lipid that plays key roles in vascular development, immune cell trafficking and regulation of vascular integrity. Lack of circulating S1P leads to constitutive vascular leak and sensitivity to passive systemic anaphylaxis, but the relative roles of different sources of S1P in these processes is unclear. This is especially true for platelets, which carry large amounts of S1P but do not contribute S1P to plasma unless activated. We have addressed roles of platelet S1P in developing and mature murine vessels in the presence or absence of other circulating S1P sources, notably red blood cells. By deletion of the genes encoding sphingosine kinases 1&2 in megakaryocytes, we generated mice with platelets that were greatly impaired in their ability to secrete S1P. These platelets were also unable to promote endothelial barrier function in vitro. Nevertheless, platelet S1P deficiency did not sensitize to bleeding during embryonic development, or in association with inflammation, irradiation or traumatic injury, suggesting that platelet S1P is dispensable for these processes. Instead, we find that recovery from anaphylactic shock is impaired in the absence of platelet-derived S1P. Consistent with the ability of aspirin to block S1P release from platelets, it impaired recovery from anaphylactic shock to a similar degree as platelet S1P deficiency. Instead of protecting vascular integrity, platelet-derived S1P appeared to act via the promotion of vascular tone through S1P2 in this context. Collectively, we find that S1P is necessary for the capacity of platelets to promote endothelial barrier function in vitro, but that this capacity becomes redundant in the presence of red blood cell-derived S1P in vivo. Nevertheless, during anaphylactic shock, both sources of S1P are necessary for complete recovery. Blocking S1P release with aspirin, an over-the-counter anti-inflammatory drug, may impair the protective functions of platelet S1P.

Les plaquettes jouent un rôle central dans l’hémostase et dans la réponse immunitaire. Elles interviennent en effet à toutes les étapes des réactions inflammatoires. Nos objectifs ont été de : (i)caractériser les mécanismes plaquettaires responsables de la prévention des saignements inflammatoires, qui sont à différencier des saignements provoqués par un traumatisme et de (ii)caractériser les déterminants de la régulation des activités cytotoxiques des neutrophiles par les plaquettes. In vivo dans un modèle de réaction immuno-induite cutanée, nous avons mis en évidence le rôle de la glycoprotéine (GP) VI dans la prévention des saignements inflammatoires provoqués par les neutrophiles. Nos résultats suggèrent que GPVI exercerait son effet protecteur par une action mécanique associée à l’activation de sa voie de signalisation ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en absence d’une agrégation plaquettaire. En revanche, dans un modèle d’inflammation pulmonaire aigue les récepteurs à ITAM, GPVI et CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2), ne sont pas requis alors que l’absence de GPIb conduit à des saignements inflammatoires. In vitro, nous avons montré que la régulation par les plaquettes des activités cytotoxiques des neutrophiles est déterminée par l’interaction préalable des neutrophiles avec les cellules endothéliales. Ainsi, nos résultats contribuent à une meilleure compréhension des fonctions des plaquettes dans les réactions inflammatoires, une première étape nécessaire au développement de nouvelles applications thérapeutiques des médicaments antiplaquettaires. / Platelets are crucial players in hemostasis and immune responses. They intervene at various stages of inflammatory reactions. Our objectives were : (i)to characterize platelet mechanisms responsible for the prevention of inflammatory bleeding, which differs from trauma-induced bleeding, and (ii)to characterize the determinants of the regulation of neutrophil cytotoxic activities by platelets. In vivo, in an immune complex-mediated cutaneous inflammation, we demonstrated the role of glycoprotein (GP) VI in the prevention of inflammatory bleeding caused by neutrophils. Our results suggest that GPVI has a protective effect, independent of platelet aggregation, by a mechanical action associated to an activation of the ITAM (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)-based signaling pathway. In contrast, in an acute pulmonary inflammatory model, the ITAM receptors GPVI and CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) were not required while the absence of platelet GPIb led to inflammatory bleeding. In vitro, we showed that physical interactions between neutrophils and endothelial cells are major determinants that guide the regulatory action of platelets towards neutrophil cytotoxic activities. In conclusion, our results contribute to a better understanding of platelet functions in inflammatory reactions, a necessary first step for future therapeutic applications of antiplatelet agents.

L’angiogenèse physiologique est un processus clé du développement embryonnaire et chez l’adulte. Une anomalie de la formation des vaisseaux sanguins est à l’origine de nombreuses pathologies. Une meilleure compréhension des mécanismes de l’angiogenèse est un pré-requis essentiel à la mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques ayant pour objectif d’inhiber ou stimuler cette angiogenèse pour mieux traiter l’ensemble de ces pathologies. Au cours de ces dernières années, les voies de signalisation Wnt/Fzd sont apparues comme jouant un rôle fondamental dans le développement vasculaire. Au début de cette thèse, un premier projet nous a permis de montrer le rôle important de Fzd7 dans le contrôle de la perméabilité vasculaire, in vitro et in vivo, via la voie canonique et la régulation des complexes jonctionnels dépendantes de la VE-cadhérine. La deuxième partie de ce travail s’est focalisé sur le rôle de Fzd7 dans la formation des vaisseaux. Nous avons mis en évidence que Fzd7 contrôle la vascularisation post-natale de la rétine chez la souris. La voie de signalisation Fzd7/DVL/β-caténine régule le sprouting et la prolifération des cellules endothéliale (CE) via l’activation de la voie Notch, tandis que la voie de signalisation de Fzd7 contrôle la migration des CE via la régulation de MMP2/9 indépendamment de la voie Notch. Enfin, la troisième partie de cette thèse a eu pour objectif d’étudier l’implication de Fzd7 sur l’angiogenèse pathologique. Nos résultats préliminaires indiquent que Fzd7 participe aux phases de vaso-oblitération et de néovascularisation dans un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène chez la souris, suggérant que Fzd7 pourrait être une nouvelle cible dans le traitement des rétinopathies. / Physiological angiogenesis is a key process in embryonic development but also in adult. Abnormal formation of blood vessels is the cause of many diseases. A better understanding of the mechanisms of angiogenesis is an essential prerequisite for the development of new therapeutic strategies aimed to inhibit or stimulate angiogenesis to better address these pathologies. In recent years, the Wnt/Fzd signaling pathways appeared to play a key role in vascular development. At the beginning of this study, a first project allowed us to show the important role of Fzd7 in controlling vascular permeability in vitro and in vivo, through the canonical pathway and the regulation of VE-cadherin junctional complexes. The second and main part of this work focused on the role of Fzd7 in the formation of blood vessels. We have demonstrated that Fzd7 controls postnatal vascularization of mice retina. The signaling pathway Fzd7/DVL/β-catenin regulates the sprouting and proliferation of endothelial cells (EC) through activation of Notch signaling, but also controls EC migration through MMP2/9 but independently of the Notch pathway. Finally, the third part of this work aimed to study the involvement of Fzd7 on pathological angiogenesis. Our preliminary data indicate that Fzd7 regulates vaso-obliteration and neovascularization in a mice model of oxygen-induced retinopathy suggesting that Fzd7 could be a new target for the treatment of retinopathy.

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