Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:54:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IzidoroJunior_MarioServulo_M.pdf: 2227378 bytes, checksum: fe650bf0745300591928bae4fac67e46 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Embora comensal da nasofaringe humana, algumas linhagens de Neisseria meningitidis ocasionalmente ultrapassam a mucosa respiratória e a barreira hematoencefálica causando doenças como meningite e septicemia. Sabe-se também que bactérias em geral possuem taxia por células cancerígenas, isto é, possuem uma predileção por infectar células tumorais. Desta forma, neste trabalho produzimos OMV de diversas linhagens de Neisseria meningitidis e analisamos as principais características físico-químicas destas vesículas e, além disso, também verificamos as principais interações desta micropartícula com a linhagem celular NG97, uma linhagem de glioblastoma, tecido pelo qual tal bactéria é conhecida por infectar em casos patológicos, por testes morfológicos in vitro e também analisamos as citocinas inflamatórias através de quantificação relativa por Real time PCR. O grande achado deste trabalho é que a utilização de ultrafiltração substituindo a ultracentrifugação na produção de OMVs é viável, menos trabalhosa e mais rápida que os métodos descritos na literatura. Além disso, as vesículas extraídas por tal processo apresentam tamanhas e cargas superficiais como os encontrados na literatura sendo que cada cepa produz diferentes quantidades de OMVs para um mesmo tempo. Ainda, observou-se que as OMVs obtidas de linhagens atenuadas para os fatores de virulência causaram menores alterações morfológicas na linhagem NG97 do que as OMVs obtidas a partir de linhagens selvagens. A influência de tais fatores de virulência, que auxiliam na interação das células do parasita com as células do hospedeiro, também foi observada na análise das citocinas inflamatórias produzidas, onde foram constatados que na ausência da pilina (proteína responsável pela aderência da bactéria com células epiteliais e endoteliais) a produção de citocinas foi praticamente nula quando comparada com suas diferentes linhagens onde este fator de virulência é presente. Para um possível uso destas vesículas como sistemas lipossomais de entrega de drogas, acredita-se que quanto mais inócua a vesícula for maior seria a biodisponibilidade da molécula antitumoral a ser entregue, como é o caso da OMV produzida pela cepa C2135 ?pilE que, além disso, possui um tamanho menor de 200nm sendo capaz de penetrar nas junções celulares da massa tumoral / Abstract: Neisseria meningitidis is a human nasopharyngeal commensal, however, some strains occasionally exceed the respiratory mucosa and the blood brain barrier causing diseases such as meningitis and septicemia. It is well established that bacteria has a natural predilection to infect cancer cells. Thus, this study produced OMVs from different strains of Neisseria meningitidis and analyzed physicochemical characteristics of these vesicles such as size and surface charge, and also, the main interactions between this nanoparticle and NG97 cell line by in vitro morphological tests and the analyze of the production of inflammatory cytokines by relative quantification Real time PCR. The major finding of this study is that the use of ultrafiltration substituting ultracentrifugation on OMVs production makes the extraction viable, less laborous and faster than previous methods. Furthermore, the vesicles extracted by this process exhibited similar sizes and surface charges when compared to the literature and each strain produces different amounts of OMVs when comparing the same production time. In this work, we also observed that the OMVs generated by attenuated strains for virulence factors induced less morphological changes in the NG97 cells than OMVs generated from wild type strains. This trend where virulence factors which assist the parasite-host cells interaction was also observed in the analysis of cytokines produced. It was observed in the absence of pilin (protein responsible for adherence of the bacteria to epithelial and endothelial cells) the production of cytokines was much lower when compared with the different strains where this virulence factor is present. For a possible use of these lipossomal vesicles as delivery systems for drugs, it is believed that the more innocuous the greater the bioavailability of the antitumor molecule to be delivered, as in the case of OMV produced by the strain C2135 ?pilE, moreover, having a size around 200 nm fits perfectly between the cell junctions allowing the nanoparticle to reach the tumor mass, but further studies are required to confirm this hypothesis / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Neisseria meningitidis B libera vesículas de membrana externa, conhecidas pela sigla OMV. Essas possuem os mesmos componentes da membrana externa da bactéria e podem ser utilizadas como antígenos em vacinas contra a meningite B. As vesículas devem, também, expressar proteínas da membrana externa (OMP) e proteínas reguladoras do íon ferro (IRP). O objetivo deste trabalho é estudar a cinética de crescimento bacteriano, consumo das fontes de carbono e nitrogênio - especialmente os limitantes de crescimento ? e produção de OMV visando melhorar a produção desse antígeno. Realizaram-se cultivos descontínuos em biorreator, com duração de 20 h, empregando meio de Catlin com limitação de ferro e modificações nas concentrações de lactato, aminoácidos e glicerol. As condições do cultivo foram: 4,2 L de meio, temperatura de 36°C, pressão de 0,5 atm, vazão de ar 1 L/min, agitação entre 250-850 rpm, controle de oxigênio dissolvido em 10% de saturação. Constatou-se que o lactato é a principal fonte de carbono limitante, embora somente se tem a hipótese de que o glicerol age como protetor mecânico. O ácido L-glutâmico é a principal fonte de nitrogênio consumida durante o cultivo. As OMV começaram a ser liberadas quantitativamente no início da fase estacionária de crescimento. Sendo que a melhor condição para a produção de OMV, valor 162,3 mg/L, é aquela em que as concentrações iniciais de lactato e aminoácidos foram duplicadas, 15,00 g/L e 2,93 g/L respectivamente. Através da análise do padrão eletroforético, confirmou-se a presença das principais proteínas de superfície, inclusive das IRPs. A integridade da OMV foi constatada por microscopia eletrônica. Assim, o antígeno obtido mostra-se passível de utilização na composição de vacina anti-meningocócica. / Neisseria meningitidis B liberates outer membrane vesicles known by the abbreviation OMV. These vesicles have the same components of the outer membrane of the bacteria and may be used as antigens in vaccines against meningitis B. The vesicles must also express outer membrane proteins (OMP) and iron regulated proteins (IRP). The aim of this paper is to study bacterial growth kinetics, carbon and nitrogen sources consumption ? specially those which limit growth ? and OMV production, seeking to improve the production of this antigen. Discontinuous bioreactor cultivations were carried out for a period of 20 hours in Catlin medium with iron restriction and modifications in lactate, amino acid, and glycerol concentrations. Cultivation conditions were: 4,2 L of medium, temperature at 36ºC, 0,5 atm, air flow rate of 1 L/min, agitation between 250-850 rpm, and dissolved oxygen control at 10% of saturation. It was verified that lactate is the main limiting carbon source, although there is just a hypothesis that glycerol acts as a mechanic protector. The L-glutamic acid is the main source of nitrogen consumed during the cultivation. The OMV started to be liberated quantitatively at the beginning of the stationary phase of growth. The best condition for production of OMV, value 162,3 mg/L, is that where the initial concentrations of lactate and amino acids were duplicated, 15,00 g/L and 2,93 g/L, respectively. Through an analysis of the electroforetic pattern, the presence of the main surface proteins was confirmed, including the IRPs. The integrity of the OMV was testified by electronic microscopy. So, the antigen thus obtained may be used in the antimeningococcal vaccine composition.

Orientador: Marcelo Lancellotti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:46:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mattos_IvesBernardellide_M.pdf: 15060536 bytes, checksum: 32a633419d15c105fec735cb5753d5b2 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada / Abstract: The abstract is available with the full electronic document when available / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Neisseria meningitidis B libera vesículas de membrana externa, conhecidas pela sigla OMV. Essas possuem os mesmos componentes da membrana externa da bactéria e podem ser utilizadas como antígenos em vacinas contra a meningite B. As vesículas devem, também, expressar proteínas da membrana externa (OMP) e proteínas reguladoras do íon ferro (IRP). O objetivo deste trabalho é estudar a cinética de crescimento bacteriano, consumo das fontes de carbono e nitrogênio - especialmente os limitantes de crescimento ? e produção de OMV visando melhorar a produção desse antígeno. Realizaram-se cultivos descontínuos em biorreator, com duração de 20 h, empregando meio de Catlin com limitação de ferro e modificações nas concentrações de lactato, aminoácidos e glicerol. As condições do cultivo foram: 4,2 L de meio, temperatura de 36°C, pressão de 0,5 atm, vazão de ar 1 L/min, agitação entre 250-850 rpm, controle de oxigênio dissolvido em 10% de saturação. Constatou-se que o lactato é a principal fonte de carbono limitante, embora somente se tem a hipótese de que o glicerol age como protetor mecânico. O ácido L-glutâmico é a principal fonte de nitrogênio consumida durante o cultivo. As OMV começaram a ser liberadas quantitativamente no início da fase estacionária de crescimento. Sendo que a melhor condição para a produção de OMV, valor 162,3 mg/L, é aquela em que as concentrações iniciais de lactato e aminoácidos foram duplicadas, 15,00 g/L e 2,93 g/L respectivamente. Através da análise do padrão eletroforético, confirmou-se a presença das principais proteínas de superfície, inclusive das IRPs. A integridade da OMV foi constatada por microscopia eletrônica. Assim, o antígeno obtido mostra-se passível de utilização na composição de vacina anti-meningocócica. / Neisseria meningitidis B liberates outer membrane vesicles known by the abbreviation OMV. These vesicles have the same components of the outer membrane of the bacteria and may be used as antigens in vaccines against meningitis B. The vesicles must also express outer membrane proteins (OMP) and iron regulated proteins (IRP). The aim of this paper is to study bacterial growth kinetics, carbon and nitrogen sources consumption ? specially those which limit growth ? and OMV production, seeking to improve the production of this antigen. Discontinuous bioreactor cultivations were carried out for a period of 20 hours in Catlin medium with iron restriction and modifications in lactate, amino acid, and glycerol concentrations. Cultivation conditions were: 4,2 L of medium, temperature at 36ºC, 0,5 atm, air flow rate of 1 L/min, agitation between 250-850 rpm, and dissolved oxygen control at 10% of saturation. It was verified that lactate is the main limiting carbon source, although there is just a hypothesis that glycerol acts as a mechanic protector. The L-glutamic acid is the main source of nitrogen consumed during the cultivation. The OMV started to be liberated quantitatively at the beginning of the stationary phase of growth. The best condition for production of OMV, value 162,3 mg/L, is that where the initial concentrations of lactate and amino acids were duplicated, 15,00 g/L and 2,93 g/L, respectively. Through an analysis of the electroforetic pattern, the presence of the main surface proteins was confirmed, including the IRPs. The integrity of the OMV was testified by electronic microscopy. So, the antigen thus obtained may be used in the antimeningococcal vaccine composition.