Regensburg, Univ, Diss., 2008

Cells from bacteria to man release extracellular vesicles (EV) such as microvesicles (MV) that carry signaling molecules like morphogens and miRNAs to control intercellular communication during health and disease. MV release also sculpts membranes, e.g. repairing damaged membranes to avoid cell death. HIV viruses also bud from the plasma membrane in a similar fashion. In order to determine the in vivo functions of MVs and regulate their release, we need to understand the mechanisms of MV release by plasma membrane budding (ectocytosis). The conserved phospholipid flippase TAT-5 maintains the asymmetric localization of phosphatidylethanolamine (PE) in the plasma membrane and was the only known inhibitor of ESCRT-mediated ectocytosis in C. elegans. Loss of TAT-5 lipid flipping activity increased the externalization of PE and accumulation of MVs. However, it was unclear how cells control TAT-5 activity to release the right amount of MVs at the right time, since no upstream regulators of TAT-5 were known. To identify conserved TAT-5 regulators we looked for new proteins that inhibit MV release. To do so, we first developed a degradation-based technique to specifically label MVs. We tagged a plasma membrane reporter with the endogenous ZF1 degradation tag (degron) and expressed it in C. elegans embryos. This reporter is protected from degradation inside MVs, but is degraded inside the cell. Thus, the fluorescence is selectively maintained inside MVs, creating the first MV-specific reporter. We identified four MV release inhibitors associated with retrograde recycling, including the class III PI3Kinase VPS-34, Beclin1 homolog BEC-1, DnaJ protein RME-8, and the uncharacterized Dopey homolog PAD-1. We found that VPS-34, BEC-1, RME-8, and redundant sorting nexins are required for the plasma membrane localization of TAT-5, which is important to maintain PE asymmetry and inhibit MV release. Although we confirmed that PAD-1 and the GEF-like protein MON-2 are required for endosomal recycling, they only traffic TAT-5 in the absence of sorting nexin-mediated recycling. Instead, PAD-1 is specifically required for the lipid flipping activity of TAT-5 that inhibits MV release. Thus, our work pinpoints TAT-5 and PE as key regulators of plasma membrane budding, further supporting the model that PE externalization drives ectocytosis. In addition, we uncovered redundant intracellular trafficking pathways, which affect organelle size and revealed new regulators of TAT-5 flippase activity. These newly identified ectocytosis inhibitors provide a toolkit to test the in vivo roles of MVs. In the long term, our work will help to identify the mechanisms that govern MV budding, furthering our understanding of the mechanisms that regulate disease-mediated EV release, membrane sculpting and viral budding. / Zellen von Bakterien bis zum Menschen produzieren Extrazelluläre Vesikel (EV) wie zum Beispiel Mikrovesikel (MV). MV können Signal Moleküle wie Morphogene und miRNA transportieren, welche die normale oder krankheitsbedingte interzelluläre Kommunikation kontrollieren. Bei der Produktion von MVs werden Membranen verformt, wie auch für die Reparatur von beschädigten Membranen um den Zelltod zu verhindern. Außerdem knospen HIV-Virus Partikel von der Plasma Membrane durch eine ähnliche Art und Weise. Um zu verstehen welche in vivo Funktion MV haben, müssen wir die Mechanismen der MV Knospung von der Plasma Membran (Ektozytose) verstehen. Die konservierte Phospholipid Flippase TAT-5 hält die asymmetrische Verteilung von Phosphatidylethanolamine (PE) in der Plasma Membrane aufrecht und war der einzig bekannte Inhibitor der von ESCRT Proteinen durchgeführten Ektozytose in C. elegans. Wenn die Lipid-flippende Funktion von TAT-5 verloren geht, wird PE externalisiert und MV sammeln sich außerhalb der Zelle an. Allerdings ist es unklar mit welchen Mechanismen die Aktivität von TAT-5 reguliert wird um die richtige Menge an MV zur richtigen Zeit zu produzieren, da die vorgeschalteten Regulatoren unbekannt sind. Um konservierte TAT-5 Regulatoren zu identifizieren suchten wir nach neuen Proteinen, die die Produktion von MV inhibieren. Dazu entwickelten wir eine Degradations-Technik um MV spezifisch zu kennzeichnen. Wir markierten einen fluoreszierenden Plasma Membran Marker mit dem endogenen ZF1 Degradations-Kennzeichen (Degron) und exprimierten es im C. elegans Embryo. Der Marker wird vor der Degradation geschützt, wenn er in einem MV von der Zelle ausgesondert wurde. Dadurch bleibt die Fluoreszenz speziell in MV erhalten, während sie innerhalb der Zelle abgebaut wird. Dadurch wurde die Sichtbarkeit von ausgeschütteten MV erhöht. Wir fanden vier Proteine, welche mit Protein Recycling in Verbindung gebracht werden, die die Ausschüttung von MV verhindern: Class III PI3Kiase VPS-34, Beclin1 Homolog BEC-1, DnaJ Protein RME-8 und das nicht näher charakterisierte Dopey Homolog PAD-1. Wir benutzten dieses Set an Proteinen, um zu testen ob und wie diese TAT-5 regulieren können. Wir fanden, dass Class III PI3Kinase, RME-8 und redundante Sorting Nexins für die Plasma Membran Lokalisierung von TAT-5 verantwortlich sind, was wichtig ist um die PE Asymmetrie aufrecht zu erhalten und die MV Produktion zu verhindern. Wenn auch PAD-1 und das GEF-ähnliche MON-2 für endosomales Recycling verantwortlich sind, regulieren sie die Lokalisation von TAT-5 nur in Abwesenheit von Sorting Nexins-reguliertem Transport. Zudem scheint PAD-1 direkt für die Lipid Translokations-Aktivität von TAT-5 verantwortlich zu sein. Demnach konnten wir zeigen, dass TAT-5 und PE Schlüsselregulatoren für MV Produktion sind, was weiterhin die Ansicht unterstützt, dass PE Externalisierung für die Ektozytose verantwortlich ist. Außerdem fanden wir, dass redundante intrazelluläre Transportwege für die Größe von Organellen verantwortlich sind und deckten neue TAT-5 Aktivitäts-Regulatoren auf. Diese neu aufgedeckten Ektozytose Inhibitoren könnten Werkzeuge sein um die in vivo Funktionen von MV zu testen. Längerfristig kann unsere Forschung dazu beitragen die Mechanismen der MV Produktion zu identifizieren und die Regulation während der krankheitsbedingten EV Produktion, der Membrane Reparatur und der Virus Knospung besser zu verstehen.

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Darmstadt.