Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-11T18:23:41Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 765581 bytes, checksum: 2e64a0f66a1ba37820f7fe967a4a87bd (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T18:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 765581 bytes, checksum: 2e64a0f66a1ba37820f7fe967a4a87bd (MD5) Previous issue date: 2016-03-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Salmonella é um dos principais micro-organismos implicados nas doenças causadas pela ingestão de alimentos contaminados e, portanto, torna-se necessário assegurar a ausência deste patógeno nos alimentos para garantir a segurança do consumidor. A maioria dos métodos de detecção de Salmonella depende da culturabilidade do patógeno nas condições de laboratório. É sabido que Salmonella pode entrar no estado conhecido como viável não cultivável (VNC) em alimentos ou no ambiente e assim, resistir durante longos períodos de tempo em condições adversas. Durante o estado VNC, a atividade metabólica das células é muito baixa, impossibilitando sua detecção por técnicas de cultivo tradicionais. Isto pode resultar em subestimação ou a não detecção de células viáveis. Considerando a escassez de informações sobre o estado VNC neste patógeno, objetivou-se, neste trabalho, avaliar condições de indução e de recuperação da culturabilidade de Salmonella no estado VNC e caracterizar a morfologia celular neste estado de resistência. A indução das células de Salmonella enterica sorovares Enteritidis e Typhimurium foi feita em solução tampão fosfato de Butterfield adicionado de 0,6 M de NaCl, solução salina (1,2 M de NaCl), ácido peracético (5,66 mg/mL) ou peróxido de hidrogênio (1,2 mg/mL) a 4 ° A culturabilidade foi acompanhada em caldo C. infusão de cérebro e coração (BHI) e a viabilidade celular foi verificada por microscopia de epifluorescência, com uso do kit Live/Dead® e citometria de fluxo. Análises morfológicas foram realizadas por microscopia de força atômica (MFA). Para a recuperação da culturabilidade foram utilizados o meio mínimo de sais (MMS) e o caldo BHI, suplementados com diferentes componentes. As condições de estresse utilizadas induziram a entrada de Salmonella no estado VNC, com variações no período de tempo para indução. Em condições de estresse nutricional e osmótico a entrada no estado VNC ocorreu em períodos acima de 93 dias, mas estas condições favoreceram a manutenção de maior percentagem de células viáveis, com valores acima de 80,9 %. Condições de estresse mais agressivas como o estresse ácido ou oxidativo induziram a entrada em estado VNC em períodos de, no máximo 24 horas, mas resultaram em percentagens de 8,51 % a 45,5 % de células viáveis. As células submetidas aos estresses nutricional e osmótico apresentaram alterações morfológicas, com redução do tamanho e alteração da forma bacilar para cocóide; alterações que não foram evidenciadas quando o estresse ácido ou oxidativo foram utilizados. O meio MMS foi mais eficiente para promover a recuperação da culturabilidade de Salmonella, particularmente quando 1 % de catalase foi incorporada ao meio. Aumento na frequência de recuperação da culturabilidade também foi constatado quando piruvato de sódio e extrato livre de células de Salmonella e Enterobacter cloacae foram adicionados aos meios de cultura. Salmonella Enteritidis demonstrou maior frequência de recuperação da culturabilidade do que Salmonella Typhimurium. Estes resultados confirmam que diferentes condições estressantes induzem Salmonella no estado VNC e que o uso de MMS acrescido de componentes, como a catalase, pode ser uma alternativa para aumentar a recuperação de células de Salmonella em estado VNC. Assim, estes resultados representam importante avanço no entendimento das condições de entrada e saída de Salmonella do estado VNC. / Salmonella is one of the main microorganisms implicated in diseases caused by food and it is necessary to ensure the absence of this pathogen in food for consumer ́s safety. Most of the methods for Salmonella detection relies on the pathogen culturability in laboratory conditions. It is known that Salmonella can be induced in a state known as viable but non culturable (VBNC) in food or in the environment and withstand in this form for long periods. During the VBNC state, the metabolic activity of the cells is very low, making it impossible to detect by traditional cultivation techniques. This may result in underestimation or failure to detect viable cells of this pathogen. Considering the few information about VBNC state in Salmonella, this study aimed to evaluate the induction of VBNC state in this pathogen, the culturability recovery conditions and characterize the cellular morphology in this state of resistance. The induction of Salmonella enterica serovar Enteritidis and Typhimurium to VBNC state was made in Butterfield phosphate buffer (0.6 M), saline solution (1.2 M NaCl), peracetic acid (5.66 mg/mL) or hydrogen peroxide hydrogen (1.2 mg/mL) at 4 ° C. The culturability was accompanied in brain heart infusion broth (BHI) and cell viability checked by epifluorescence microscopy with the Live / Dead® kit and flow cytometry. Morphological analyzes were performed by atomic force microscopy (AFM). For the recovery of culturability, minimal salts medium (MMS) and BHI broth supplemented with different components. All stress conditions used induced Salmonella into VBNC state and, the time for the VBNC state induction varying. In the starvation and osmotic treatment, VBNC state was detected after 93 days of treatment, but these conditions favored the maintenance of a higher percentage of viable cells, with values above 80.9%. More aggressive stress conditions as acid or oxidative stress induced the cells into VBNC state in periods shorter than 24 hours, but resulted in a percentage of 8.51% to 45.5% viable cells. Cells undergoing starvation and osmotic stress showed morphological changes, reducing the size and changing the bacillary form to coccoid but these changes were not apparent when the acid or oxidative stress were used. The medium MMS was more efficient to promote recovery Salmonella culturability, particularly when 1% catalase was incorporated into the medium. Higher frequency of recovery was also observed when sodium pyruvate and cell free extract of Salmonella and Enterobacter cloacae were added to the media. Among the serotypes used, Salmonella Enteritidis showed higher frequency of recovery than Salmonella Typhimurium. These results confirm that different stress conditions can induce Salmonella to enter in the VBNC state, and the use of MMS plus various components, particularly catalase, can be an alternative to ensure the recovery of Salmonella cells and facilitate the detection of the pathogen in food. Thus, these results represent an important advance in the understanding of the conditions of entry and exit of Salmonella VBNC state. / Não foi localizado o currículo lattes do autor.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2496359 bytes, checksum: 3acf1d82313dda08bea8e0ab625fe65e (MD5) Previous issue date: 2012-08-08 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Salmonella enterica is a foodborne pathogen able to enter in viable but nonculturable state (VNC) in response to adverse environmental conditions. S. enterica is capable to produce (p)ppGpp, a nucleotide responsible for controlling gene expression at the level of transcription and translation in nutritional stress conditions. Due to gene expression determined by the accumulation of (p)ppGpp, S. enterica supports various environmental conditions. The aims of this work were to quantify by real time PCR the expression of the genes mreB, related to the cytoskeleton, and rpoS, which codifies stress response genes, in single and double mutants of Salmonella Enteritidis PT4 578 deficient in the synthesis of (p)ppGpp, due to the mutation on gene relA, which codifies a GTP pyrophosphokinase, and, or spoT, which codifies guanosine-3',5'-diphosphate 3'-pyrophosphohydrolase, submitted to nutritional stress and cold shock; to induce these strains to VNC state in Butterfield phosphate solution (BPS), in the absence or presence of sodium chloride at 4 ºC and to evaluate the morphology of these strains in logarithmic growth phase and in VNC state. The expression of gene mreB was reduced in both mutant strains (single and double) after 25 days in stress condition. However, the double mutant presented an increase in rpoS gene expression after 25 days in the same stress condition. Wild and mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578 entered in VNC state after incubation in BPS in the absence or presence of sodium chloride at 4 °C, in different periods of time. Single and double mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578 in logarithmic growth phase presented filamentous cells. On the other hand, VNC cells of single and double mutants showed a reduction in diameter, volume and length and also transition from bacillary to coccoid form. In conclusion, the expression of mreB and rpoS genes in single and double mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578 was different when compared to the wild strain. There was also alteration in the morphology of cells in log phase when compared to the VNC cells of mutant strains of Salmonella Enteritidis PT4 578. However, the (p)ppGpp molecule is not essential for induction and permanence of this bacterium in VNC state. / Salmonella enterica é um patógeno de origem alimentar capaz de entrar no estado viável não cultivável em resposta a condições ambientais adversas. S. enterica é capaz de produzir (p)ppGpp, um nucleotídeo responsável pelo controle da expressão gênica no nível da transcrição e da tradução, em condições de estresse nutricional. Em razão da expressão gênica determinada pelo acúmulo de (p)ppGpp, S. enterica suporta condições ambientais variadas. Este trabalho teve como objetivos: quantificar por PCR em tempo real a expressão dos genes mreB, relacionado ao citoesqueleto e, rpoS, que codifica genes de resposta ao estresse, de estirpes mutantes simples e duplo da Salmonella Enteritidis PT4 578 deficientes na síntese de (p)ppGpp, em razão de mutação no gene relA, que codifica uma GTP pirofosfoquinase, e,ou spoT, que codifica guanosina-3',5'-difosfato 3'-pirofosfohidrolase submetidas aos estresses nutricional e choque frio; induzir essas estirpes ao estado VNC em solução fosfato de Butterfield (BPS) acrescida ou não de cloreto de sódio a 4 ºC e avaliar a morfologia dessas estirpes em fase logarítmica de crescimento e no estado VNC. A expressão do gene mreB foi reduzida para ambas as estirpes mutantes (simples e duplo) após 25 dias em condição de estresse. No entanto, o mutante duplo apresentou um aumento na expressão do gene rpoS após 25 dias nesta mesma condição de estresse. As estirpes de Salmonella Enteritidis PT4 578 selvagem e mutantes entraram no estado VNC após incubação em BPS acrescido ou não de cloreto de sódio a 4 °C em diferentes tempos. Estirpes de Salmonella Enteritidis PT4 578 mutantes simples e duplo em fase logarítmica de crescimento apresentaram células filamentosas. Em vez disso, células VNC de mutantes simples e duplo mostraram redução no diâmetro, volume e comprimento e também transição da forma bacilar para a forma cocoide. Concluiu-se que a expressão dos genes mreB e rpoS das estirpes de Salmonella Enteritidis PT4 578 mutantes simples e duplo difere da estirpe selvagem. Houve também mudança da morfologia entre as células da fase log e células VNC das estirpes mutantes de Salmonella Enteritidis PT4 578. No entanto, a molécula de (p)ppGpp não é importante para indução e permanência no estado VNC desta bactéria.