INTRODUÇÃO: O receptor tipo Toll 4 (TLR4) pertencente a uma família de receptores do sistema imune inato, reconhece o padrão molecular de lipopolissacarídeos (LPS), expressos por bactérias Gram negativas. Sua cascata de sinalização, nas células apresentadoras de antígeno, ocorre por duas vias principais: MyD88-dependente, que resulta na ativação de NF-B e na expressão de genes de resposta inflamatória e MyD88-independente, responsável pela ativação dos fatores IRF3 e IRF7, culminando na síntese de interferons e , envolvidos na resposta anti-viral e anti-bacteriana. Células não-imunes, de diversos tecidos, também expressam TLR4, incluindo células pancreáticas murinas e humanas. Devido ao seu papel nos processos inflamatórios, os TLR estão implicados em doenças crônicas como obesidade e diabetes. Estudo anterior do grupo identificou TLR4 como uma molécula que ativa sinais inflamatórios e provoca alterações na homeostase das células . Neste trabalho, investigamos qual via é ativada por LPS e quais os efeitos da expressão do TLR4 na viabilidade celular e na produção de insulina em células murinas. MÉTODOS: Células MIN6 (linhagem celular de insulinoma de camundongo) foram cultivadas em condições de hipo (2,8mM glicose), normo (5,6mM glicose) e hiperglicemia (11,2mM glicose), por 4 dias. Após esse período, foi adicionado LPS (50 ng/mL) por 48h e foram feitas análises por PCR em tempo real, Western Blot, ELISA e citometria de fluxo. RESULTADOS: Os resultados confirmam o aumento de TLR4 em células em condições de hiperglicemia e a via de sinalização ativada por LPS é a via MyD88-dependente, envolvida na produção de citocinas pró-inflamatórias. A via de indução de intérferons tipo 1 está ausente nestas células. Além disso, TLR4 ativado por LPS aumentou secreção de insulina em resposta a glicose, mas não induziu a morte celular. CONCLUSÃO: A expressão de TLR4 em células pancreáticas murinas é induzida em resposta ao aumento da glicemia, constituindo um novo elo entre a agressão à célula causada por altos níveis de glicose e a alteração da função celular induzida por LPS / INTRODUCTION: Toll-like receptor 4 (TLR4) belongs to a family of innate immunity receptors and recognizes the molecular pattern present in lipopolysaccharides (LPS), typical of Gram-negative bacteria. There are two TLR4 signaling pathways, typically in antigen-presenting cells: one is MyD88-dependent, activating NF-kB transcription factor and triggering inflammatory cytokine production and the other is MyD88-independent, leading to activation of IRF3 and IRF-7 and production of interferons e , involved in antiviral and antibacterial immune responses. Non-immune cells in several tissues also express TLR4, including human and murine pancreatic cells. Due to their role in inflammatory processes, TLRs have been implicated in chronic diseases like obesity and diabetes. Our previous study identified TLR4 as a molecule which activates inflammatory signals and induces changes in cell homeostasis. In this study, we investigated which of the TLR4 pathways is activated by LPS and the effects of glucose levels on cell viability and insulin production in a mouse insulinoma cell line. METHODS: MIN6 cells were maintained in low (2,8mM), normal (5,6mM) and high (11,2mM) glucose levels for 4 days, and then incubated with LPS (50 ng/mL) for 48 hours. Analyses were done by real-time PCR, Western Blot, ELISA and flow cytometry. RESULTS: Analysis confirmed increase in TLR4 gene expression in hyperglycemic conditions and showed that the signaling pathway activated by LPS is MyD88-dependent. The interferon induction pathway is absent in these cells. Furthermore, upon activation by LPS, TLR4 impacts on insulin secretion in response to glucose, but without triggering cell death. CONCLUSION: We conclude that TLR4 expression in mouse pancreatic cells is induced in response to increased glucose levels, constituting a new link in the chain of events leading to cell stress caused by high glucose levels with concomitant changes in cell function induced by LPS

INTRODUÇÃO: O receptor tipo Toll 4 (TLR4) pertencente a uma família de receptores do sistema imune inato, reconhece o padrão molecular de lipopolissacarídeos (LPS), expressos por bactérias Gram negativas. Sua cascata de sinalização, nas células apresentadoras de antígeno, ocorre por duas vias principais: MyD88-dependente, que resulta na ativação de NF-B e na expressão de genes de resposta inflamatória e MyD88-independente, responsável pela ativação dos fatores IRF3 e IRF7, culminando na síntese de interferons e , envolvidos na resposta anti-viral e anti-bacteriana. Células não-imunes, de diversos tecidos, também expressam TLR4, incluindo células pancreáticas murinas e humanas. Devido ao seu papel nos processos inflamatórios, os TLR estão implicados em doenças crônicas como obesidade e diabetes. Estudo anterior do grupo identificou TLR4 como uma molécula que ativa sinais inflamatórios e provoca alterações na homeostase das células . Neste trabalho, investigamos qual via é ativada por LPS e quais os efeitos da expressão do TLR4 na viabilidade celular e na produção de insulina em células murinas. MÉTODOS: Células MIN6 (linhagem celular de insulinoma de camundongo) foram cultivadas em condições de hipo (2,8mM glicose), normo (5,6mM glicose) e hiperglicemia (11,2mM glicose), por 4 dias. Após esse período, foi adicionado LPS (50 ng/mL) por 48h e foram feitas análises por PCR em tempo real, Western Blot, ELISA e citometria de fluxo. RESULTADOS: Os resultados confirmam o aumento de TLR4 em células em condições de hiperglicemia e a via de sinalização ativada por LPS é a via MyD88-dependente, envolvida na produção de citocinas pró-inflamatórias. A via de indução de intérferons tipo 1 está ausente nestas células. Além disso, TLR4 ativado por LPS aumentou secreção de insulina em resposta a glicose, mas não induziu a morte celular. CONCLUSÃO: A expressão de TLR4 em células pancreáticas murinas é induzida em resposta ao aumento da glicemia, constituindo um novo elo entre a agressão à célula causada por altos níveis de glicose e a alteração da função celular induzida por LPS / INTRODUCTION: Toll-like receptor 4 (TLR4) belongs to a family of innate immunity receptors and recognizes the molecular pattern present in lipopolysaccharides (LPS), typical of Gram-negative bacteria. There are two TLR4 signaling pathways, typically in antigen-presenting cells: one is MyD88-dependent, activating NF-kB transcription factor and triggering inflammatory cytokine production and the other is MyD88-independent, leading to activation of IRF3 and IRF-7 and production of interferons e , involved in antiviral and antibacterial immune responses. Non-immune cells in several tissues also express TLR4, including human and murine pancreatic cells. Due to their role in inflammatory processes, TLRs have been implicated in chronic diseases like obesity and diabetes. Our previous study identified TLR4 as a molecule which activates inflammatory signals and induces changes in cell homeostasis. In this study, we investigated which of the TLR4 pathways is activated by LPS and the effects of glucose levels on cell viability and insulin production in a mouse insulinoma cell line. METHODS: MIN6 cells were maintained in low (2,8mM), normal (5,6mM) and high (11,2mM) glucose levels for 4 days, and then incubated with LPS (50 ng/mL) for 48 hours. Analyses were done by real-time PCR, Western Blot, ELISA and flow cytometry. RESULTS: Analysis confirmed increase in TLR4 gene expression in hyperglycemic conditions and showed that the signaling pathway activated by LPS is MyD88-dependent. The interferon induction pathway is absent in these cells. Furthermore, upon activation by LPS, TLR4 impacts on insulin secretion in response to glucose, but without triggering cell death. CONCLUSION: We conclude that TLR4 expression in mouse pancreatic cells is induced in response to increased glucose levels, constituting a new link in the chain of events leading to cell stress caused by high glucose levels with concomitant changes in cell function induced by LPS