Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1949. / Typescript. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 30-33).

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

MONTEIRO, Sandra Maria Nunes. Eficácia da suplementação com glutamina, peptideos, vitaminas A e E, na doença diarréica induzida por metotrexato e pela toxina do Vibrio cholerae : restabelecimento da barreira morfofuncional intestinal. 2004. 167 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, 2004. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-10-17T13:34:59Z No. of bitstreams: 1 2004_tese_smnmonteiro.pdf: 1305742 bytes, checksum: 36e5ca209ccb56d647a5ffddbcb9d2d9 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2012-10-18T12:04:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2004_tese_smnmonteiro.pdf: 1305742 bytes, checksum: 36e5ca209ccb56d647a5ffddbcb9d2d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-18T12:04:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2004_tese_smnmonteiro.pdf: 1305742 bytes, checksum: 36e5ca209ccb56d647a5ffddbcb9d2d9 (MD5) Previous issue date: 2004 / A desnutrição, desidratação e agentes antineoplásicos, tais como o metotrexato (MTX), são imediatos causadores das doenças diarréicas. Objetivando investigar a mucosite intestinal (MI) induzida por MTX, a eficácia das soluções de reidratação oral (SRO) acrescidas com glutamina (Gln), alanilglutamina (Ala-Gln), Hyprol 4107 (HYP) e hyfoama (HYFO) utilizou-se a perfusão intestinal. E para a suplementação com vitaminas A (VITA) e E (VITE), Gln e peptídeos, utilizou-se as avaliações morfométricas, metabólicas e a de permeabilidade intestinal [(teste lactulose/manitol (L/M)], em camundongos (n=344) e em coelhos (n=72). A mucosite intestinal por MTX (2,75 mg/kg/24h s.c., durante 3 dias) foi validada em camundongos, através da constatação do quadro diarréico e do prejuízo no estado nutricional (-1.89±0,52 g) estabelecido após o 3o dia de tratamento. A análise morfométrica demonstrou achatamento de vilos (364,8±19.9 mm) e hiperplasia de criptas (251±19.2 mm) intestinais com aumento do número de apoptoses (7.48±1, 23/cripta), no duodeno e no jejuno. A taxa L/M no grupo MTX foi maior c que no controle (0,35). A perfusão intestinal com toxina da cólera aumentou a secreção de Na+ (-12,8±1.4 mEq/g/min), Cl- (-12,9±4,6 mEq/g/min) e de água (-0,02 ±0,04 ml/g/min). As SRO acrescidas de Gln e peptídeos, restauram este efeito secretório. A suplementação de Gln e peptídeos, VITA e VITE, melhoram o ganho ponderal, a ingestão de ração, as alterações morfológicas e a apoptose, no modelo de mucosite intestinal. Nenhuma alteração foi observada no padrão de mitoses nas criptas intestinais, após o 3o dia de tratamento com MTX. A suplementação nutricional reduziu na mucosite, a elevação das taxas de L/M (0,35 para 0,73) nas vias paracelular e transcelular. Nossos resultados sugerem que, o restabelecimento da barreira morfofuncional, induzido pela suplementação, foi obtido através de um aumento do transporte de cátions (Na+ e K+) na mucosa, do fornecimento de substrato energético para o enterócito, inibição da apoptose (0,25±0,05), de células indiferenciadas incremento no potencial redox e redução da peroxidação lipídica das células intestinais diferenciadas. Então sugerimos que o uso de SRO acrescidas de Gln e peptídeos podem prevenir a desnutrição e reduzir as doenças diarréicas, e a suplementação com VITE e VITA melhorar a morfo fisiologia da barreira intestinal. / A desnutrição, desidratação e agentes antineoplásicos, tais como o metotrexato (MTX), são imediatos causadores das doenças diarréicas. Objetivando investigar a mucosite intestinal (MI) induzida por MTX, a eficácia das soluções de reidratação oral (SRO) acrescidas com glutamina (Gln), alanilglutamina (Ala-Gln), Hyprol 4107 (HYP) e hyfoama (HYFO) utilizou-se a perfusão intestinal. E para a suplementação com vitaminas A (VITA) e E (VITE), Gln e peptídeos, utilizou-se as avaliações morfométricas, metabólicas e a de permeabilidade intestinal [(teste lactulose/manitol (L/M)], em camundongos (n=344) e em coelhos (n=72). A mucosite intestinal por MTX (2,75 mg/kg/24h s.c., durante 3 dias) foi validada em camundongos, através da constatação do quadro diarréico e do prejuízo no estado nutricional (-1.89± 0,52 g) estabelecido após o 3o dia de tratamento. A análise morfométrica demonstrou achatamento de vilos (364,8± 19.9 µm) e hiperplasia de criptas (251± 19.2 µm) intestinais com aumento do número de apoptoses (7.48± 1, 23/cripta), no duodeno e no jejuno. A taxa L/M no grupo MTX foi maior c que no controle (0,35). A perfusão intestinal com toxina da cólera aumentou a secreção de Na+ (-12,8± 1.4 µEq/g/min), Cl- (-12,9± 4,6 µEq/g/min) e de água (-0,02 ± 0,04 ml/g/min). As SRO acrescidas de Gln e peptídeos, restauram este efeito secretório. A suplementação de Gln e peptídeos, VITA e VITE, melhoram o ganho ponderal, a ingestão de ração, as alterações morfológicas e a apoptose, no modelo de mucosite intestinal. Nenhuma alteração foi observada no padrão de mitoses nas criptas intestinais, após o 3o dia de tratamento com MTX. A suplementação nutricional reduziu na mucosite, a elevação das taxas de L/M (0,35 para 0,73) nas vias paracelular e transcelular. Nossos resultados sugerem que, o restabelecimento da barreira morfofuncional, induzido pela suplementação, foi obtido através de um aumento do transporte de cátions (Na+ e K+) na mucosa, do fornecimento de substrato energético para o enterócito, inibição da apoptose (0,25± 0,05), de células indiferenciadas incremento no potencial redox e redução da peroxidação lipídica das células intestinais diferenciadas. Então sugerimos que o uso de SRO acrescidas de Gln e peptídeos podem prevenir a desnutrição e reduzir as doenças diarréicas, e a suplementação com VITE e VITA melhorar a morfo fisiologia da barreira intestinal.

M.Sc. (Biochemistry) / Cholera, the highly epidemic diarrhoeal disease caused by Vibrio cholerae (V. cholerae) infection, continues to devastate many developing countries. Therefore, a rapid and sensitive method to identify pathogenic V. cholerae biotypes is imperative. Literature highlighted the sensitivity of matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and high resolution melt curve analysis (HRM) for this purpose. It is necessary to develop these methods based on the virulence proteins/genes themselves in order to be future diagnostic tools capable of detecting distinct strains of V. cholerae and to determine their pathogenicity. Such virulence proteins/genes would require significant sequence variation among different strains of V. cholerae. The toxin-coregulated pilus protein A (TcpA) is a key player in V. cholerae infection and displays significant sequence variation at both the genetic and protein level. The hypothesis of this study is that the variation in the TcpA/tcpA protein and gene, respectively, can be used to differentiate between V. cholerae biotypes by using MALDI-TOF MS and/or HRM methods. The objectives were first to investigate established methods for the rapid isolation of surface proteins that would yield a high enough concentration of whole pili or TcpA subunits for future MS biotyping techniques. Two methods were evaluated: a) pili isolation by mechanical shearing b) crude extraction of the outer membrane proteins and associated surface proteins. Secondly, HRM-compatible oligonucleotides were designed for specific amplification of the variable regions within the tcpA gene in V. cholerae. The efficacy of these oligonucleotides was tested on V. cholerae reference strains and environmental isolates. Lastly, a current standard procedure for V. cholerae typing was evaluated. Pili were successfully isolated from bacterial cell colonies, but large quantities of starting material were required and much of the cell content was isolated with the pili. Alternative isolation and enrichment methods have been proposed and may prove promising for future MALDI-TOF MS biotyping. The current standard procedure for V. cholerae typing with multiplex PCR revealed some discrepancies between the multiplex PCR steps. Therefore, the current multiplex PCR procedure may result in inaccuracies during typing. The designed HRM-compatible oligonucleotide set designated Contig 1 successfully amplified a 101 bp region within the tcpA gene in Vibrios. This Contig 1 oligonucleotide set could possibly be used in future studies to differentiate between Vibrio species with HRM. Further studies would be needed for the development of MALDI-TOF/MS or HRM as future rapid and specific environmental monitoring systems based on the TcpA/tcpA protein or gene, respectively.

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published_or_final_version / Microbiology / Master / Master of Philosophy

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol inst., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Göteborg : Univ. , 2009. / Härtill 3 uppsatser.

Vibrio cholerae, der Erreger der Cholera, ist ein Gram-negatives, fakultativ pathogenes Bakterium. In dieser Arbeit konnte die V. cholerae Oberflächenstruktur identifiziert werden, an die der temperente V.cholerae-Phage K139 adsorbiert. Phagenbindungs-Studien mit gereinigtem Lipopolysaccharid (LPS) ergaben, daß das O-Antigen der Serogruppe O1 den Phagenrezeptor darstellt. Zusätzlich wurden phagenresistente Mutanten des transluzenten O1 El Tor Inaba Stammes P27459 nach Inkubation mit einem lytischen K139-Derivat isoliert. Analysen des LPS-Laufverhaltens in Polyacrylamid-Gelen (PAA) zeigten, daß viele der Spontanmutanten defekte LPS-Moleküle synthetisierten, die entweder im O-Antigen, im Kernoligosaccharid oder in beidem betroffen waren.Phagenresistente Mutanten mit offensichtlich unverändertem LPS bildeten entweder transluzente oder opake Kolonien. Weiterhin wurden ausgewählte spontan phagenresistente Stämme genetisch analysiert. O-Antigen Mutanten wurden in Southernblot-Analysen mit spezifischen, gegen das bereits gut charakterisierte O-Antigen-Biosynthese-Gencluster (rfb) gerichtete Sonden untersucht. Zwei der O-Antigen negativen Stämme waren durch Insertion des IS-Elementes IS1004 in das rfb-Gencluster entstanden. Spontan phagenresistente Mutanten mit verändertem Kernoligosaccharid ohne O-Antigen (R-LPS-Mutanten) sind wahrscheinlich im Kernoligosaccharid-Biosynthese-Gencluster (waa) mutiert, das in der V. cholerae Datenbank identifiziert wurde. waaF, das für die Heptosyl-II-Transferase kodiert, wurde durch genetische Manipulation inaktiviert und zeigte im PAA-Gel das gleiche Migrationsverhalten wie zwei spontan phagenresistente Mutanten. In den Spontanmutanten konnte jedoch im Gegensatz zu der konstruierten Mutante durch ein WaaF-exprimierendes Plasmid lediglich das Kernoligosaccharid, nicht aber das O-Antigen wiederhergestellt werden. Weitere genetische Analysen ergaben, daß eine der Spontanmutanten 546 bp deletiert hatte, die Teile von waaF und waaL betrafen, letzteres kodiert dabei vermutlich für die O-Antigen-Ligase. Spontanmutanten mit intaktem O-Antigen aber verändertem Kernoligosaccharid konnten als galU-Mutanten charakterisiert werden, die auch im Galaktosekatabolismus beeinträchtigt waren. Zusätzlich wurden zwei weitere gal-Gene, galE und galK, durch genetische Manipulation inaktiviert. Diese Mutanten konnten ebenfalls keine Galaktose mehr verstoffwechseln, synthetisierten aber ein intaktes LPS. In Gegenwart hoher Galaktosekonzentrationen wurde in galU- und galE- Mutanten aufgrund der Defekte im Gal-Stoffwechsel Lyse beobachtet. Zusätzlich wurde die Rolle von galU und galE in der Biofilmbildung untersucht. Da der transluzente Wildtyp (Wt) im Gegensatz zu Opakvarianten keinen Biofilm bilden konnte, wurden galE und galU auch in einer Opakvariante inaktiviert. galU- und galE-Mutationen erzeugten in der Opakvariante wieder eine transluzente Koloniemorphologie und einen biofilm-negativen Phänotyp an abiotischen Oberflächen. Diese Daten deuten an, daß die Synthese von UDP-Galaktose ausgehend von UDP-Glukose für die Synthese des Exopolysaccharides (VPS) notwendig ist. Virulenzstudien in neugeborenen Mäusen ergaben, daß O-Antigen negative Stämme sowie galU-Mutanten sehr viel schlechter und R-LPS-Mutanten nicht mehr im Dünndarm kolonisieren konnten. Da galE und galEK-Mutanten ebenso gut wie der Wt kolonisierten, konnte ausgeschlossen werden, daß toxische Galaktose-Effekte für den Kolonisierungsdefekt der galU-Mutante verantwortlich waren. Zusätzlich wurde die Überlebensfähigkeit der LPS-Mutanten in Gegenwart von verschiedenen Substanzen, die nachweislich im menschlichen Dünndarm vorkommen, unter „in vitro“ Bedingungen untersucht. R-LPS und galU-Mutanten waren im Vergleich mit dem Wt sensitiver gegenüber schwachen organischen Säuren, Defensinen, dem Komplementsystem und Gallensäuren. O-Antigen negative Stämme waren dagegen weiterhin resistent gegenüber Gallensäuren und schwachen organischen Säuren aber sensitiv gegen die Komponenten des angeborenen Immunsystems. Bisher wurde für keine der LPS-Mutanten eine größere Beeinträchtigung weiterer Virulenzfaktoren, wie z.B. Motilität, Synthese der Pili TCP oder Choleratoxin-Produktion festgestellt. Auch die Zusammensetzung der Proteine in der äußeren Membran war offensichtlich nicht beeinträchtigt, allerdings wurde beobachtet, daß aus galU Mutanten in geringem Maße und aus R-LPS Mutanten in verstärktem Maße periplasmatische Proteine in den Überstand diffundieren können. Diese Ergebnisse deuten an, daß nicht nur das O-Antigen, wie bereits bekannt, sondern auch eine spezifische Kernoligosaccharid-Struktur für eine effektive Kolonisierung von V. cholerae essentiell ist. Der Grund dafür ist höchstwahrscheinlich in der Ausbildung einer stabilen äußeren Membran zu suchen, die die Persistenz in Gegenwart bakteriozider Substanzen des Dünndarms ermöglicht. / Vibrio cholerae is a Gram-negative, facultative pathogen and is the causative agent of cholera. In this study the adsorption site of the temperate phage K139 on the bacterial cell surface was determined. Phage-binding studies with purified lipopolysaccharide (LPS) showed that the O-antigen of the serogroup O1 serves as the phage receptor. In addition, phage resistant mutants of the O1 El Tor Inaba strain P27459 were screened by using a virulent isolate of phage K139. Analysis of the LPS by PAGE migration patterns revealed that most of the spontaneous mutants synthesize incomplete LPS molecules, either composed of defective O-antigen or core oligosaccharide. Phage resistent isolates with apparently normal LPS form either translucent or opaque colonies. The genetic nature of spontaneous phage resistant strains was investigated. O-antigen negative strains were investigated by Southern hybridization with probes specific for the well known O1-antigen biosynthesis cluster (rfb). Two of the investigated O-antigen negative mutants revealed insertions of element IS1004 into the rfb-gene cluster. Spontaneous phage resistant R-LPS mutants were found to synthesize an altered core without attached O-antigen. This type of mutants are most likely affected in the core oligosaccharide biosynthesis gene cluster (waa), which was identified by searching the V. cholerae genomic database. waaF, encoding heptosyl-II-transferase, was inactivated and the LPS was found to have the same migration behaviour in PAA gels than two spontaneous mutants. However, in contrast to the constructed waaF mutant complementation with waaF in trans restored only the core oligosaccharide but not the O-antigen synthesis in the spontaneous mutants. Further analysis revealed that one mutant had a deletion of 546 bp affecting waaF and waaL, the latter is thought to encode the putative O-antigen-ligase. Spontaneous mutants with intact O-antigen but altered core oligosaccharide were identified as galU mutants, which were also affected in the galactose catabolism. Other gal genes, galE and galK, were inactivated and these mutants were also found to be defective in the catabolism of exogenous galactose but synthesized an apparently normal LPS. Additionally, galU and galE mutants were found to lyse in the presence of high galactose concentrations. Furthermore the role of galU and galE in biofilm formation was investigated. In contrast to the spontaneous phage resistant opaque colony variant the translucent wt-strain was unable to form a biofilm, therefore the galE and galU mutations were also introduced into the opaque colony variant. galU and galE mutants of the opaque strain were translucent and unable to form a biofilm on abiotic surfaces, suggesting that the synthesis of UDP-galactose, via UDP-glucose, is essential for the biosynthesis of the exopolysaccharide. Virulence studies in infant mice indicated that O-antigen negative mutants, galU and R-LPS mutants but not galE and galEK mutants were defective in colonization of the mouse small intestine, excluding any toxic galactose effects in the gut. By investigating the sensitivity to several substances known to be present in the intestine „in vitro“, it was shown that galU and R-LPS mutants were more sensitive to weak organic acids, cationic antimicrobial peptides, the complement system and bile salts. O-antigen negative strains were found to be sensitive against gut-associated bacteriocidal substances, but they displayed significant resistance to bile salts and organic acids. No gross change in other virulence determinants such as motility, synthesis of pili TCP, choleratoxin production or outer-membrane proteins has yet been found for any of the LPS mutants. However, some periplasmic leakage for galU and significant leakage for R-LPS mutants was observed. These results suggest that not only the O-antigen, as already known, but also a specific core oligosaccharide architecture seems to be required for V. cholerae colonization, most probably in providing resistance against bacteriocidal substances.

Obwohl inzwischen über 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbrüche der Cholera hauptsächlich von Stämmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor näher zu untersuchen, wurden Adhäsionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgeführt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte für eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85%, für eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70% in der Adhäsionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls möglich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur für die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schlüsselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberflächenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Primärstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abhängig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivität einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verfügung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS für eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifität der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivität der Galaktosyltransferase WavM, essentiell für die Aktivität der Gal-abhängigen Ligase von V194. Die Gal-unabhängige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdomäne für Gal in der C-terminalen Hälfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminosäuren (AS) in verschiedenen Ligasen führte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven führte zum Verlust der Ligase-Aktiviät von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach möglichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. Über die Anpassungen von V. cholerae an aquatische Ökosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarität, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher für eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erklärung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen führt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erhöhten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. Während die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, führte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt. / Although, more than 200 serogroups of V. cholerae.were identified, however, only the strains of the non-encapsulated O1 and the encapsulated O139 serogroups were found to be responsible for cholera epidemics. The components of the LPS of O1 and O139 play a crucial role in the colonization of the gastrointestinal tract. To analyze the contribution of the LPS and the capsule in the adhesion to epithelial cells, mucus layer attachment studies using defined O antigen and/ or capsule mutants of both serogroups and the human intestinal cell line HT29-Rev MTX were performed. In case of the O antigen mutant of O1 a 85% and for the O antigen and capsule mutant of O139 a 70% reduction in the adhesion rate was determined compared to wild type. It is likely that ToxR regulated gene products also contribute to the adhesion, since a toxR-mutant of O1 showed a 3-fold reduction in the adhesion rate. In addition the two gene products of the core oligosaccharide biosynthesis, WavJ and WavD, were characterized. So far the corresponding genes could only be found in the wa*-gene cluster type 1 of clinical isolates. It could be demonstrated, that single and double knockout mutants have an effect on core oligosaccharide biosynthesis in both serogroups. Based on bioinformatical data it is likely that WavJ represents the heptosyl-IV-transferase. Double mutants in wavJ and wavD of both serogroups showed an attenuated growth in the presence of novobiocin, whereas only the mutants in O139 demonstrated reduced colonization in the in vivo mouse model. The surface polymer:lipid A-core ligase (WaaL), also called the O antigen ligase, is a key enzyme in the LPS biosynthesis of Gram- bacteria. Part of this work focused on the structural and functional characteristics associated with the recognition of the core oligosaccharide of two distantly related ligases of a virulent (P27459) and an environmental (V194) V. cholerae isolate. It was demonstrated that the activity of both ligases is dependent on the presence of N-acetylglucosamine, which is attached to the core oligosaccharide by the WavL glycosyltransferase. The gene wavL could be found in all V. cholerae isolates so far. In contrast, an additional sugar substitution, i.e. galactose, which is transfered by the WavM galactosyltransferase, discriminates the core oligosaccharide specificity of the ligases of P27459 and V194. The activity of WavM is essential for the activity of the galactose-dependent ligase of V194, whereas it hinders the galactose-independent ligase of P27459 to transfer the O antigen onto the core oligosaccharide. WaaL protein hybrids between galactose dependent and non-dependent ligases indicate that the galactose recognition site is located in the C-terminal half. Using PhoA and LacZ fusions the topology of the ligase of P27459 was determined. Amino acid sequence alignments of WaaL proteins identified the distinct conserved motifs R(X3)L and H(X10)G in two periplasmic loops. By site directed mutagenesis of the histidine and arginine residues within these motifs, an abortism of O antigen transfer reaction for WaaLs of V. cholerae and Salmonella enterica was found. Furthermore the putative O antigen-transport systems of V. cholerae were investigated. In this work a new transposon system was constructed and established, resulting in 3600 mutants, which were screened for growth defects under hypertonic conditions. One of these mutants had an insertion in locus VCA0565, which encodes a putative sensor histidine kinase. In combination with the transcriptional regulator, encoded by VCA0566, they represent the putative two-component system OsmRK. Comparing the transcriptom of osmR/ K-mutants to the wild type revealed no explanation for the osmosensitive phenotype, but showed some interaction between the regulon of OsmR/ K and ToxR. Analysis of the outer membrane demonstrated, that a mutation in osmR/ K results in a repression of OmpU under hypertonic conditions. Comparative experiments, including additional mutants indicated a degradation of ToxR in osmR/ K- and toxS-mutants in presence of high salt concentrations. In contrast to osmR/ K-mutants, in the toxS-mutant the repression of OmpU could be also observed by a different membrane stress caused by protamine. In addition, the analysis of the outer membrane proteins revealed a C-terminal degradation of HutA under hypertonic stress conditions.