Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden verschiedene Liposomen-DNA-Komplexe zum Gentransfer charakterisiert sowie die Aufnahme und Verteilung in der Zellkultur untersucht werden. Dabei waren vor allem solche Präparationen von besonderem Interesse, die in unserer Arbeitsgruppe 'Drug Targeting' getestet oder entwickelt und verwendet wurden, wie Sendai-Virus Liposomen (HVJ-Liposomen), Virosomen sowie DAC-Chol und DOCSPER-Liposomen als Vertreter der kationischen Lipide.<br /> <br /> Im ersten Teil der Arbeit wurden fusogene Liposomen und Virosomen charakterisiert. Bei diesen Untersuchungen wurden folgende Ergebnisse erzielt:<br /> ·Sendai-Viren fusionieren mit Liposomen unterschiedlicher Lipidzusammensetzung. <br /> ·Die daraus resultierenden HVJ-Liposomen sind mit elektronenmikroskopischen Methoden identifizierbar.<br /> ·Die Spikes auf den HVJ-Liposomen besitzen fusogene Eigenschaften. <br /> ·HVJ-Liposomen eignen sich auf Grund der geringen Ausbeute sowie der geringen Transfektionseffizienz nicht zum in vitro Gentransfer.<br /> ·Virosomen stellen einen weiteren Typ fusogener Gentransfervesikel dar.<br /> ·Ihre Größe und fusogenen Eigenschaften sind abhängig von der externen Zugabe einer optimierten Lipidmischung.<br /> ·Im Innenraum der Virosomen kann mit Poly-L-Lysin vorkomplexierte DNA verkapselt werden.<br /> ·Die fusogenen Eigenschaften der Virosomen wurden mit Hilfe immunelektronenmikroskopischer Techniken und monoklonaler Antikörper gegen Hämagglutinin/Neuraminidase und das Fusionsprotein sowie mit polyklonalen Antiseren gezeigt.<br /> ·An Hand goldmarkierter DNA sind Virosomen nach der Transfektion in der Zelle nachweisbar.<br /> <br /> Da in unserer Arbeitsgruppe bevorzugt kationische Liposomen zum Gentransfer verwendet werden, wurde auch die Struktur der Liposomen untersucht und folgende Ergebnisse dokumentiert:<br /> ·Die Struktur und die Größe kationischer Liposomen werden hauptsächlich durch die Lipidzusammensetzung bestimmt. <br /> ·Die Bildung von Liposomen-DNA-Komplexen ist mit einer Größenzunahme der Komplexe gekoppelt.<br /> ·Die Anzahl gebundener Plasmide steigt mit der Größe der Lipoplexe. <br /> ·Gentransferaktive Lipopolyplexe (mit Protaminsulfat komplexierte DNA und DAC-Chol- Liposomen) sind kleiner als Lipoplexe. Ihre Struktur wird von der Zusammensetzung bestimmt. <br /> <br /> Eine weitere wichtige Frage betrifft den Weg der Gencarrier in der Zelle. Kenntnisse über diese Vorgänge sind vorteilhaft, um die einzelnen Schritte zu verstehen und möglichst gezielt zu verbessern.<br /> Bei der Untersuchung der Partikel im Hinblick auf zelluläre Barrieren beim Gentransfer konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: <br /> ·Die Bindung der Partikel an die Zellmembran und Aufnahme sind abhängig von den eingesetzten Zellen und Komplexen sowie derInkubationszeit.<br /> ·Die Aufnahme erfolgt über endozytotische Mechanismen, wobei Lipopolyplexe schneller als Lipoplexe in die Zellen gelangen. Nicht alle gebundenen Komplexe werden aufgenommen.<br /> ·Die aufgenommenen Partikel befinden sich in Endosomen und werden ins Innere der Zelle transportiert. <br /> ·Freisetzung der DNA und Eintritt in den Zellkern über Kernporen konnte nicht beobachtet werden.<br /> ·DNA-haltige Vesikel in Kernnähe deuten auf einen weiteren Mechanismus hin (Vesikeltransfer zum Zellkern). / The aim of this work is the characterisation of several liposome DNA complexes for in vitro gene transfer and uptake as well as their distribution in cultured cell lines using electron microscopy. The particles used were fusogenic liposomes made from Sendai virus, virosomes and cationic liposomes. <br /> At first fusogenic liposomes and virosomes were characterised. The results obtained are summarised below:<br /> ·Sendai virus can fuse with liposomes made from different lipid composition.<br /> ·HVJ-liposomes are detectable using electron microscopy techniques. <br /> ·The spikes from HVJ-liposomes have fusogenic properties.<br /> ·HVJ-liposomes are not suitable for in vitro gene transfer due to the low amount of fusogenic liposomes leading to low transfection efficiency.<br /> ·Virosomes, reconstituted virus envelopes, are another type of fusogenic vesicles.<br /> ·Size and morphology of virosomes depends on the addition of an optimised lipid mixture. <br /> ·PLL treated DNA is entrapped into virosomes.<br /> ·Monoclonal and polyclonal antibodies and protein A gold technique can be used for the detection of viral glycoproteins on virosomes. ·Gold labelled DNA was used to show the distribution in cultured cells.<br /> <br /> In order to characterise the structure of cationic liposomes following results were obtained:<br /> ·Size and structure depends on the lipid composition.<br /> ·The formation of liposomes leads to an increase of the size.<br /> ·Larger lipoplexes contain more DNA.<br /> ·Lipopolyplexes composed of DNA complexed with protamine sulphate and DAC- Chol liposomes are smaller than lipoplexes. Their structure depends on the composition.<br /> <br /> To improve transfection ability examination of the cellular barriers is useful.<br /> With regard to the fate of lipoplexes following results were obtained.<br /> ·Binding depends on the cell line, kind of particles and incubation time.<br /> ·Uptake occurs through endocytosis. Lipopolyplexes enter the cells faster than larger lipoplexes.<br /> ·Lipoplexes are enclosed in endosomes and were carried into the centre of the cell.<br /> ·Escape of DNA from endosomes and entry into nucleus were not visible.<br /> ·Vesicles with DNA were observed near the nucleus. There is an opportunity for another pathway to the nucleus.

Respiratory syncytial virus (RSV) causes a common infection that is associated with a range of respiratory illnesses from common cold-like symptoms to serious lower respiratory tract illnesses such as pneumonia and bronchiolitis. RSV is the single most important cause of serious lower respiratory tract illness in children < 1 year of age. Host innate and acquired immune responses activated following RSV infection have been suspected as contributing to RSV disease. Toll-like receptors (TLRs) activate innate and acquired immunity and are candidates for playing key roles in the host immune response to RSV. Leukocytes express TLRs including TLR2, TLR6, TLR3, TLR4, and TLR7 that can potentially interact with RSV and promote immune responses following infection. Using knockout mice, we have demonstrated that TLR2 and TLR6 signaling in leukocytes can activate innate immunity against RSV by promoting TNF-α, IL-6, CCL2 (MCP-1), and CCL5 (RANTES) production. As previously noted, TLR4 also contributed to cytokine activation (71, 90). Furthermore, we demonstrated that signals generated following TLR2 and TLR6 activation were important for controlling viral replication in vivo. Additionally, TLR2 interactions with RSV promoted neutrophil migration and dendritic cell activation within the lung. Collectively, these studies indicate that TLR2 is involved in RSV recognition and subsequent innate immune activation and may play a role in modulating acquired immune responses through DCs. Despite the fact that RSV is the single most important cause of infant upper respiratory tract disease, there are no licensed vaccines available to prevent RSV disease. We have developed a virus-like particle (VLP) vaccine candidate for RSV. The VLP is composed of the NP and M proteins of Newcastle disease virus (NDV) and a chimera protein containing the cytoplasmic and transmembrane domains of the NDV HN protein and the ectodomain of the human RSV G protein (H/G). BALB/c mice immunized with 10 or 40 μg total VLP-H/G protein by intraperitoneal or intramuscular inoculation stimulated antibody responses to G protein as good as or better than comparable amounts of UV-inactivated RSV. Furthermore, VLP-H/G induced robust CTL responses in vaccinated animals. Immunization with two or even a single dose of these particles resulted in the complete protection of BALB/c mice from RSV replication in the lungs. Upon RSV challenge of VLP-H/G immunized mice, no enhanced pathology in the lungs was observed, although lungs of mice immunized in parallel with formalin-inactivated RSV (FI-RSV) showed the significant pathology that has been previously observed with FI-RSV vaccination. Thus, the VLP-H/G candidate vaccine was immunogenic in BALB/c mice and prevented replication of RSV in murine lungs with no evidence of immunopathology. These data support further development of virus-like particle vaccine candidates for RSV.