La grippe, infection respiratoire virale fréquente, est due aux virus Influenza. Leur génome est constitué par huit molécules d'ARN de polarité négative retrouvés sous la forme de complexe ribonucléique (RNPv). Au cours du cycle viral, il a été démontré que les régions terminales des segments de gène étaient cruciales pour l'incorporation sélective des huit RNPv à l'intérieur des particules virales. Par des techniques d'interaction in vitro et de tomographie électronique, nous avons montré que les segments de gène du virus H3N2 interagissaient entre eux par des interactions ARN/ARN impliquant leurs régions de packaging. Nos résultats suggèrent que la mise en place de ce réseau permettrait la formation d'un complexe supra macromoléculaire multi-segmenté permettant l'incorporation d'un jeu complet des huit RNPv dans les particules virales néosynthetisées. En raison de la nature segmentée du génome viral, des phénomènes de réassortiment génétique peuvent avoir lieu lors d'une co-infection. Afin de définir les mécanismes responsables de la restriction observée lors de ce phénomène, nous avons évalué le taux de réassortiment génétique in vitro entre le virus humain H3N2 et le virus aviaire H5N2. Nos résultats suggèrent que le mécanisme gouvernant l'incorporation sélective des segments de gènes, régulerait le réassortiment génétique. Nous avons montré que la modulation de l'interaction ARN/ARN entre les segments de gènes HA et M permet d'augmenter le taux d'incorporation du segment de gène HA H5 dans le fond génétique du virus humain, prérequis pour l'émergence de virus pandémique

L'empaquetage des huit segments du génome des virus influenza de type A est une des étapes clef du cycle viral. Il intervient également dans l'apparition de virus réassortants, les virus pandémiques par exemple, ce qui en fait un enjeu fondamental de la recherche actuelle.Nous avons étudié ce mécanisme au cours de deux études, la première portant sur les vaccins antigrippaux (réassortiment), la seconde visant à construire un virus vecteur (incorporation d'un segment hétérologue). Les semences vaccinales sont obtenues par co-infection d'oeufs de poule embryonnés avec deux souches virales une donneuse (souche circulante de référence) et une accepteuse (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8)). L'analyse de la composition génétique de treize semences vaccinales H3N2 montre que le segment PB1 de la souche donneuse est présent dans plus de 50 % des semences analysées et qu'une grande variété de réassortants,allant de 6:2 à 2:6 (PR8:H3N2), peut résulter de ces coinfections. Des expériences de compétition d'encapsidation de segments à l'aide de la génétique inverse révèlent que l'encapsidation sélective du segment PB1 dépend de son environnement génétique notamment l'origine virale des segments HA et NA. La seconde partie de mon travail de thèse a été consacrée à la construction d'un vecteur réplicatif sur la base d'un virus influenza H3 naturel sans segment NA. Aucune des constructions contenant le transgène gfp n'a été incorporée dans les particules virales, contrairement à ce qui a été décrit dans la littérature. Bien que les mécanismes moléculaires régissant l'incorporation des segments des virus influenza A demeurent très complexes, le fond génétique semble être déterminant pour ce processus.

L’empaquetage des huit segments du génome des virus influenza de type A est une des étapes clef du cycle viral. Il intervient également dans l’apparition de virus réassortants, les virus pandémiques par exemple, ce qui en fait un enjeu fondamental de la recherche actuelle.Nous avons étudié ce mécanisme au cours de deux études, la première portant sur les vaccins antigrippaux (réassortiment), la seconde visant à construire un virus vecteur (incorporation d’un segment hétérologue). Les semences vaccinales sont obtenues par co-infection d’oeufs de poule embryonnés avec deux souches virales une donneuse (souche circulante de référence) et une accepteuse (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8)). L'analyse de la composition génétique de treize semences vaccinales H3N2 montre que le segment PB1 de la souche donneuse est présent dans plus de 50 % des semences analysées et qu’une grande variété de réassortants,allant de 6:2 à 2:6 (PR8:H3N2), peut résulter de ces coinfections. Des expériences de compétition d'encapsidation de segments à l’aide de la génétique inverse révèlent que l'encapsidation sélective du segment PB1 dépend de son environnement génétique notamment l’origine virale des segments HA et NA. La seconde partie de mon travail de thèse a été consacrée à la construction d’un vecteur réplicatif sur la base d’un virus influenza H3 naturel sans segment NA. Aucune des constructions contenant le transgène gfp n’a été incorporée dans les particules virales, contrairement à ce qui a été décrit dans la littérature. Bien que les mécanismes moléculaires régissant l’incorporation des segments des virus influenza A demeurent très complexes, le fond génétique semble être déterminant pour ce processus. / The packaging of the eight segments corresponding to the influenza A viruses genomeis a key process of the viral replication as well as a stake of actual scientific researchesbecause it leads to reassortant viruses, e.g. pandemic viruses. We studied the two main facetsof influenza segment packaging: reassortment, during vaccine seeds production and foreignsegment incorporation for influenza vector construction. Vaccine seeds are produced bycoinfection of hens’ eggs with two viruses, a donor one (reference circulating strain) and anacceptor one (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (PR8)). Analysis of internal genetic composition ofthirteen H3N2 vaccine seeds reveals that PB1 segment of H3N2 donor strain is incorporatedin more than fifty per cent of the cases. Moreover, coinfection events lead to an extremelywide range of reassortants from 6:2 to 2:6 (PR8:H3N2). Segment incorporation competitionassays performed using plasmid-based reverse genetics show that selective packaging of PB1segment is based on genetic environment, i.e. viral origin of HA and NA segments. Thesecond part of my PhD work has been devoted to replicative influenza vector based on H3virus isolated from patients without NA segment at the native stage. None of the gfptransgenic constructions containing reporter gene have been incorporated in viral particles,contrary to literature studies performed using H1N1 laboratory-adapted strains. Even ifmolecular mechanisms controlling influenza A viruses segments incorporation remain stillcomplex, genetic background seems to be an essential element which must be considered withinterest.

La grippe, infection respiratoire virale fréquente, est due aux virus Influenza. Leur génome est constitué par huit molécules d’ARN de polarité négative retrouvés sous la forme de complexe ribonucléique (RNPv). Au cours du cycle viral, il a été démontré que les régions terminales des segments de gène étaient cruciales pour l’incorporation sélective des huit RNPv à l’intérieur des particules virales. Par des techniques d’interaction in vitro et de tomographie électronique, nous avons montré que les segments de gène du virus H3N2 interagissaient entre eux par des interactions ARN/ARN impliquant leurs régions de packaging. Nos résultats suggèrent que la mise en place de ce réseau permettrait la formation d’un complexe supra macromoléculaire multi-segmenté permettant l’incorporation d’un jeu complet des huit RNPv dans les particules virales néosynthetisées. En raison de la nature segmentée du génome viral, des phénomènes de réassortiment génétique peuvent avoir lieu lors d’une co-infection. Afin de définir les mécanismes responsables de la restriction observée lors de ce phénomène, nous avons évalué le taux de réassortiment génétique in vitro entre le virus humain H3N2 et le virus aviaire H5N2. Nos résultats suggèrent que le mécanisme gouvernant l’incorporation sélective des segments de gènes, régulerait le réassortiment génétique. Nous avons montré que la modulation de l’interaction ARN/ARN entre les segments de gènes HA et M permet d’augmenter le taux d’incorporation du segment de gène HA H5 dans le fond génétique du virus humain, prérequis pour l’émergence de virus pandémique / The Flu is a frequent viral infectious disease caused by the Influenza viruses. Their genomes are composed by eight negative single-stranded RNA organised as vRNPs. During the viral cycle, the terminal non-coding and coding regions of viral genome have been shown to be crucial for the selective incorporation of a complete set of the eight vRNPs into influenza viral particles. Band shift assay and electron tomography allowed us to show that all gene segments interact together by RNA/RNA interactions involving their packaging region. Our results suggest that the eight genomic vRNAs are selected and packaged as an organized supramolecular complex held together between identified packaging regions into neosynthesized virions. Due to genome segmented nature, genetic reassortment can occur during co-infection. In order to identify molecular mechanisms responsible for the observed restriction during the genetic reassortment, we have developed a new competitive reverse genetic strategy allowing us to evaluate the genetic reassortment between H3N2 and H5N2 viruses. Our results suggest that mechanism controlling the packaging should regulate genetic reassortment. We have shown that the modulation of RNA/RNA interaction between HA and M gene segment have allowed us to increase HA H5 gene segment incorporation rate into a viral human genetic background, prerequisite for pandemic virus emergency