Vitamin K ist ein essentieller Cofaktor für die posttranslationale Gamma-Carboxylierung von sog. Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren, Knochenproteinen, Zellwachstum-regulierenden und weiteren Proteinen mit noch unbekannter Funktion. Defekte im Vitamin K-Stoffwechsel führen einerseits zu zwei verschiedenen Formen des familiären Mangels aller Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren (VKCFD1 und 2) und andererseits zur Resistenz oder Hypersensitivität gegenüber Cumarinderivaten, wie Warfarin, die als Vitamin K-Antagonisten zur Antikoagulationstherapie bei thromboembolischen Erkrankungen, aber auch zur Bekämpfung von Ratten und Mäusen eingesetzt werden. Die Aufklärung und Charakterisierung der molekularen Ursachen dieser Erkrankungen wird in dieser Doktorarbeit anhand von Veröffentlichungen dokumentiert. Ausgehend von der Charakterisierung zweier Familien mit dem VKCFD2-Phänotyp, wird die Kartierung des VKCFD2-Locus auf dem kurzen Arm von Chromosom 16 beschrieben. Durch eine systematische Mutationssuche in der ca. 130 Gene umfassenden Kandidatenregion von Chromosom 16 konnte das für diese Erkrankung und die Warfarinresistenz ursächliche Gen ausfindig gemacht werden. Dabei handelt es sich um das Gen für die entscheidende Komponente der Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1), die den Recycling-Prozess von Vitamin K im sog. Vitamin K-Zyklus katalysiert. Die Charakterisierung des VKORC1-Proteins umfasst dessen subzelluläre Lokalisation, den Vergleich orthologer Proteine in verschiedenen Species und die funktionelle Charakterisierung von rekombinant exprimiertem VKORC1. Durch positionsspezifische Mutagenesen und anschließende Expression in humanen Nierenzellen konnten mehrere für die Funktion der VKORC1 relevante Aminosäuren identifiziert werden. Die posttranslationale Modifikation der Vitamin K-abhängigen Proteine wird von der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (GGCX) katalysiert. Defekte in diesem Enzym wurden von zwei verschiedenen Arbeitsgruppen als Ursache für die erste Form der VKCFD-Erkrankung nachgewiesen. In dieser Doktorarbeit werden drei weitere, von unserer Arbeitsgruppe identifizierte Mutationen im GGCX-Gen beschrieben, unter denen sich ein nachgewiesener Founder-Effekt an Position 485 des Proteins befindet. Die Arg485Pro-Variante wurde rekombinant in Insektenzellen exprimiert und konnte mittels kinetischer Studien als VKCFD1-verursachende Mutation verifiziert werden. / Vitamin K is an essential cofactor for the posttranslational gamma-carboxylation of the so-called vitamin K-dependent coagulation factors, bone proteins, cell growth regulating proteins and others of unknown function. Defects in vitamin K metabolism cause two different forms of combined deficiency of vitamin K-dependent coagulation factors (VKCFD type 1 and type 2) as well as resistance or hypersensitivity to coumarin derivates, such as warfarin, which act as vitamin K antagonists. Coumarins are used for anticoagulation therapy of thromboembolic diseases and in higher dosis also for rodent pest control. The aim of this thesis is to characterize the molecular basis of these diseases. This work has led to six publications. The VKCFD type 2 phenotype as described in two unrelated families was used to perform a homozygosity mapping of the VKCFD2 locus on the short arm of chromosome 16. A systematic mutation screening in the candidate region on chromosome 16 comprising approximately 130 putative genes resulted in the identification of the gene causative for VKCFD2 and the allelic phenotype warfarin resistance. This gene encodes the first identified component of the vitamin K epoxide reductase (VKORC1) which catalyzes the reduction of vitamin K epoxide as an important part of the so-called vitamin K cycle. Characterization of the VKORC1 protein includes its subcellular localization, comparison of orthologous proteins in different species and functional studies of the recombinant VKORC1. Amino acids which are relevant for protein structure or function were identified by site-directed mutagenesis experiments and subsequent expression in human embryonic kidney cells (HEK293). Posttranslational modification of the vitamin K-dependent proteins is catalysed by the gamma-glutamyl carboxylase (GGCX), an enzyme of the endoplasmic reticulum. Mutations in the gene encoding this enzyme were demonstrated to be causative for VKCFD type 1 by two different working groups. Our working group identified three additional mutations in the GGCX gene. Recurrent mutations at position 485 of the protein were shown to result from a founder effect. The Arg485Pro variant was recombinantly expressed in insect cells using the baculovirus system and could be verified as a causative mutation for the VKCFD1 phenotype by kinetic studies.

Seit der Entdeckung des ersten Gens für den Vitamin K Epoxid-Reduktase-Komplex (VKORC1), dem Schlüssel-Enzym für die Regenerierung von Vitamin K, sind keine zusätzlichen Komponenten des Komplexes beschrieben worden. Die einzige bekannte Funktion von VKORC1 ist bislang die Reduktion von Vitamin K-2,3-Epoxid, welches bei der post-translationalen Carboxylierung von Proteinen als oxidierter Kofaktor anfällt, und im sogenannten Vitamin K-Zyklus regeneriert wird. VKORC1 ist zugleich das Zielprotein antikoagulativer Medikamente der Coumarin-Gruppe, wie Warfarin oder Marcumar. Mutationen im VKORC1-Gen führen zu einem signifikanten Effekt auf die benötigte Coumarin-Dosis und die Stabilität der Hämostase in der Thrombosebehandlung mit Antikoagulanzien. Gleichzeitig mit VKORC1 wurde ein stark sequenz-homologes Protein identifiziert, das „VKORC1-like1“ (VKORC1L1) genannt wurde und dessen physiologische Funktion zu Beginn dieser Arbeit völlig unbekannt war. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit zwei Aspekten des Vitamin K-Stoffwechsels: A. Den enzym-kinetischen Eigenschaften und der subzellulären Lokalisation des VKORC1L1-Proteins sowie B. der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen, die Interaktionspartner der beiden VKOR-Proteine sein können. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden: A.1. Die enzym-kinetischen Untersuchungen zeigen starke Ähnlichkeiten zwischen VKORC1 und VKORC1L1: Beide Enzyme haben eine Vitamin K-Epoxidase- und -Reduktase-Aktivität, wobei die Affinitäten zu Vitamin K2-Epoxid deutlich höher sind als die zu Vitamin K1-Epoxid. Beide Enzyme sind durch Warfarin hemmbar und der Austausch der vermutlich am Elektronentransfer beteiligten Cysteine an homologen Positionen führt in beiden Proteinen zu einem fast vollständigen Verlust der Aktivität. A.2. Mittels Ko-Lokalisation konnte VKORC1L1 – wie VKORC1 – in der ER-Membran lokalisiert werden. Folglich schließen wir, dass VKORC1L1 eine ähnliche Struktur, die gleiche zelluläre Lokalisation und zumindest in vitro auch eine VKOR-Aktivität hat und daher eventuell eine weitere Komponente des VKOR-Komplexes darstellen könnte. Allerdings sprechen gewichtige Argumente dagegen, dass beide Proteine funktionell austauschbar sind: Sowohl bei Patienten mit Mutationen in VKORC1 (VKCDF2-Erkrankung), als auch bei VKORC1-Knock-out Mäusen kann das intaktes VKORC1L1-Protein die inaktivierende Mutation im C1-Gen nicht kompensieren. B.1. Mit einem für Membranproteine adaptierten, modifizierten Yeast-Two-Hybrid Screen (Split-Ubiquitin-System) konnten mit VKORC1 und VKORC1L1 als Köder 114 Proteine aus einer Leber-cDNA-Bank als potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Davon wurden 6 Proteine aufgrund ihrer Trefferhäufigkeit und funktioneller Überlegungen mit Hilfe von Ko-Immunpräzipitationsexperimenten und Ko-Immunlokalisation näher untersucht. Interessanterweise zeigen die beiden Trefferlisten starke Überschneidungen. B.2. Es konnte eine in vitro- Interaktion von VKORC1 mit sich selbst und mit VKORC1L1 nachgewiesen werden, die bisher nicht bekannt war. Dies könnte auf der hohen Sequenz- und Struktur-Homologie der beiden Proteine beruhen, führt aber auch zu neuen Hypothesen bezüglich des Vitamin K-Stoffwechsels. B.3. Die Interaktion von VKORC1 und dem „stress-associated endoplasmic reticulum protein 1“ (SERP1) bringt Vitamin K in Zusammenhang mit oxidativem Stress. Dazu passen auch die neuesten Ergebnisse aus der Arbeitsgruppe von Johannes Oldenburg (vormals Würzburg, jetzt Bonn) zur Funktion von VKORC1L1, die eine protektive Rolle von Vitamin K beim Schutz der Zelle vor reaktiven Sauerstoffverbindungen nahe legen. Ob und wie Vitamin K und VKORC1L1 einen neuen Schutzmechanismus gegen Sauerstoffradikale bilden bedarf weiterer Untersuchungen. B.4. Ferner wurde eine Interaktion zwischen VKORC1 und dem „Emopamil-binding-protein“ (EBP) nachgewiesen. Mutationen in EBP führen zu der seltenen genetischen Krankheit Chondrodysplasia punctata. Die Ähnlichkeit der Symptomatik zwischen Chondrodysplasia punctata und der sogenannten Warfarin-Embryopathie, die durch überhöhte Dosierung von Coumarinen während der Schwangerschaft verursacht wird, legt einen Zusammenhang zwischen Vitamin K- und dem Kalziumstoffwechsel nahe. B5. In den Ko-Immunpräzipitationsexperimenten nicht bestätigt haben sich die initial positiven Proteine Protein-Disulfid-Isomerase (PDIA6), CD63, und Fibrinogen-Gamma (FGG). Die Ergebnisse geben Hinweise auf neue Funktionen der VKOR-Proteine beim Schutz vor oxidativem Stress und in der Verbindung zum Kalzium-Stoffwechsel. Beide Aspekte bedürfen weiterführender Untersuchungen. Im Hinblick auf diese neuen Funktionen wäre auch eine kritische Betrachtung der übrigen 85 primären Treffer des Split-Ubiquitin-Screens sinnvoll. / Since the first gene of the vitamin K epoxide reductase complex (VKORC1) - the key enzyme for the regeneration of vitamin KH2 - has been discovered, no more components of the complex have been described. To date, the only known function of VKORC1 is the reduction of vitamin K-2,3-epoxide (VKO) in the vitamin K cycle. VKO plays a role as an oxidative cofactor during post-translation carboxylation. VKORC1 is also the target protein of anticoagulant drugs of the coumarin type (e.g. warfarin or marcumar). Genetic variants in VKORC1 have recently been shown to significantly affect the coumarin dose and the stability of hamostasis (measured as INR level) during thrombosis treatment. Simultaneously with VKORC1, a homologues protein called VKORC1-like1 (VKORC1L1) was identified. The physiological function of VKORC1L1 was unknown at the beginning of this thesis. The present thesis focuses on two aspects: A. Kinetic properties and subcellular localization of VKORC1L1-protein as well as B. identification and characterization of potential interaction partners of VKORC1 and VKORC1L1, respectively. The results could be summarised as follows: A.1. Kinetic studies revealed a high similarity of VKORC1 and VKORC1L1: Both VKOR-proteins have shown a VKR-activity in our assay and a higher affinity for Vitamin K2-epoxid than for Vitamin K1-epoxid. Both enzymes could be inhibited by warfarin and the exchange of homologous Cysteins leads to an almost complete loss of function for both proteins. A.2. Localisation studies identified VKORC1L1 in the ER when co-expressed in HeLa cells with VKORC1. Accordingly, we suggest that VKORC1L1 has a similar function, localisation and structure as VKORC1 and therefore becomes a potential component of the VKOR-complex. Nevertheless, important arguments lead to the fact that both proteins are not interchangeable as neither patients with VKCDF2 nor VKORC1-knock out mice could be counterbalanced by VKORC1L1. B. Using the split-ubiquitin-system, a method based on yeast two-hybrid system which is capable to investigate membrane-proteins, 114 potential interactions candidates for VKORC1 and VKORC1L1 were found in a human adult liver cDNA library screen. 5 of them were further investigated using co-immunprecipitation and co-localisation studies. Interestingly, various similar hits could be detected for both proteins. B.1. For the first time we were able to show an in vitro-interaction of VKORC1 with itself and the homologues protein VKORC1L1. This might be due to the high level of homology between the two proteins but also leads to a new hypothesis in respect to the vitamin K metabolism. B.2. The interaction of VKORC1 and “stress-associated endoplasmatic reticulum protein 1” (SERP1) connects vitamin K with oxidative stress. This is in accordance with new results from the group of J. Oldenburg (formerly Würzburg, now Bonn). They postulate an antioxidant role of VKORC1L1. Whether VKORC1L1 and vitamin K have an antioxidative effect needs to be solved in further studies. B.2. Furthermore, we showed an interaction between VKORC1 and the “emopamil binding protein” (EBP). Genetic variants in EBP lead to a rare genetic disease chondrodysplasia punctata which can be considered a phenocopy of warfarin embryopathy, which is caused by medication of woman with coumarin derivatives during the first trimester of pregnancy. This interaction and the similar phenotypes suggest a connection between the vitamin K- and calcium metabolism. B.3. The following proteins, which were found using split-ubiquitin-system, could not be confirmed via co-immunoprecipitaion: protein-disulfide-isomerase A6 (PDIA6), CD63, a member of the tetraspanin-family, and fibrinogen-gamma-chain (FGG). A PDI-form was proposed to provide electrons for reduction of the thioredoxin-like CXXC center in VKORC1. Tetraspanins are a large family of cell-surface proteins, which interact with proteins in a molecular network that is known as the tetraspanin web. FGG is the gamma component of fibrinogen, the only identified protein which is known to play a role in blood coagulation. These results suggest new functions of VKOR-proteins related to protection against oxidative stress and a connection to the calcium-metabolism. Both aspects need to be analysed further. Therefore, it would make sense to analyse the remaining candidates found via split-ubiquitin-system with regard to these new functions.