Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.