Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Augustina Gentile / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:33:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Feltrim_Daniela_M.pdf: 2255232 bytes, checksum: c1f34d09fda3a2de4f7c62d0c7b9ec71 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O presente trabalho possui como objetivo caracterizar fisiológica e funcionalmente um gene de milho que têm expressão relacionada com a tolerância ao cultivo em solo ácido contendo níveis tóxicos de alumínio (Al). Este gene, denominado Zmwrky69, foi identificado na linhagem de milho Cat100-6, tolerante ao Al (Mattiello et al., 2010). A análise da sequência da proteína ZmWRKY69 indica que ela pertence ao grupo III dessa família de fatores de transcrição, apresentando o motivo WRKYGKQ na região amino terminal e o motivo dedo de zinco Cx7Cx23HxC na região carboxi terminal. A proteína ZmWRKY69 está localizada no núcleo, conforme inferido por ensaio de localização subcelular em epitélio de cebola empregando uma fusão da proteína de milho com a proteína verde fluorescente (GFP). Ensaios de duplo híbrido em levedura indicam que a proteína ZmWRKY69 interage com um receptor de giberelina, uma proteína envolvida com a regulação por auxinas e uma proteína com função desconhecida. Plantas transgênicas de tabaco superexpressando Zmwrky69 apresentaram menor inibição do crescimento radicular na presença de Al, comparativamente às plantas selvagens. Esses resultados indicam que o gene Zmwrky69 codifica um fator de transcrição que apresenta um papel importante na tolerância ao Al em milho / Abstract: The objective of the present work is to characterize a gene differentially expressed in the maize inbred line Cat100-6 (aluminum tolerant) grown in acidic soil containing toxic levels of aluminum. This gene called Zmwrky69 was identified in the aluminum tolerant Cat100-6 inbred line (Mattiello et al., 2010). The sequence analysis of the ZmWRKY69 protein indicated that it belongs to the group III of this transcription factor family classification. The protein has the motif WRKYGKQ in the amino terminal region and a zinc finger motif Cx7Cx23HxC in the carboxi terminal region. This protein is localized in the nucleus as inferred by subcellular localization in onion epidermis using a maize protein fused to the Green Fluorescent Protein (GFP). Yeast two-hybrid essays indicate that the protein ZmWRKY69 interacts with a gibberellin receptor, a protein involved in auxin regulation and a protein with an unknown function. Transgenic tobacco plants overexpressing Zmwrky69 presented a lower degree of root growth inhibition in the presence of Al compared to wild type plants. These results indicate that Zmwrky69 gene encodes a transcription factor that presents an important role in Al tolerance in maize / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Le lin cultivé (Linum usitatissimum L.) est l’une des principales sources de lignanes, faisant de cette plante un modèle d’étude de cette voie du métabolisme spécialisé. Les principaux lignanes de lin dérivent de composés optiquement actifs, en particuliers les stéréoisomères du sécoisolaricirésinol qui sont synthétisés à partir de pinorésinol via laricirésinol. Les principales enzymes impliquées dans la synthèse de ces stéréoisomères sont deux isoformes de pinorésinol-laricirésinol réductases (PLR) déjà caractérisées et possédant des énantiospécificitées opposées. Néanmoins l'action de ces deux réductases bifonctionnelles ne permet pas d'expliquer les profils d'accumulation complexes notamment de laricirésinol et ses dérivés observés dans les graines, tiges et suspensions cellulaires de lin. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en oeuvre menant à ces profils d’accumulation de lignanes chez cette plante, la recherche de nouvelles PLRs a révélé l’existence de deux nouvelles isoformes. L’analyse de l'expression des gènes ainsi que l'activité enzymatique in vitro de ces deux nouvelles PLR putatives, LuPLR3 et LuPLR4 ont été élucidées. LuPLR4, in vitro, présente une activité réductase uniquement du pinorésinol. Ce type d’activité est ici décrit pour la première fois en dehors de la famille Brassicées et permet d’expliquer en partie les profils d’accumulation complexes observés chez le lin. De par leurs propriétés biocides, les lignanes sont suspectés jouer un rôle dans les mécanismes de défense des plantes. Dans le cadre de ce travail, suite à une élicitation fongique à l’aide d’extraits de Fusarium oxysporum spp. linii, un agent pathogène commun du lin, l’analyse de l’expression des différents gènes codant les isoformes de PLRs a révélées une induction globale et coordonnée. En particulier, dans le cas de l’isoforme LuPLR1, des délétions et mutations dans la région promotrice de son gène ont permis de mettre en évidence une région impliquée dans la régulation de la réponse à l’élicitation par F. oxysporum. Cette région contient plusieurs boîtes W, sites de liaison putatifs pour des facteurs de transcription de type WRKY. Les facteurs de transcription WRKY jouent un rôle dans les réponses aux stress biotique et abiotique. Un facteur de transcription candidat LuWRKY36 a été isolé à partir de suspensions cellulaires traitées avec des éliciteurs de F. oxysporum ou de l'acide abscissique. En particulier, les expériences de gel-retard et DPI-ELISA ont montré la capacité de liaison de LuWRKY36 à la boîte W3 présente du promoteur du gène LuPLR1. Cette régulation a ensuite été confirmée in vivo. Nous rapportons également l'impact différentiel de l'élicitation par des extraits de F. oxysporum sur l’expression des gènes LuWRKY36 et LuPLR1 ainsi que la production de sécoisolaricirésinol dans les variétés de lin sensible (Barbara) et résistante (Baïkal) à la fusariose. Enfin, la pleine exploitation des nombreux effets bénéfiques (en santé humaine ou cosmétique notamment) du sécoisolaricirésinol et des autres composés phénoliques accumulés dans les graines de lin nécessitent la mise au point de procédés d’extraction “verts”, efficaces voir sélectifs. Nous rapportons ici que l’utilisation de solvants eutectiques de type NADES (Natural Deep Eutectic Solvent) qui couplée à une extraction assistée par ultrasons, dans le cadre d’un procédé de type cracking, utilisant comme matériel de départ un coproduit d’extraction de l’huile de lin produit de manière innovante, permet d’obtenir des rendements d’extraction élevés et sélectifs de ces différents composés d’intérêt dans le cadre d’une démarche d’éco-extraction. / L. usitatissimum is one of the richest sources of lignans. Main flax lignan is optically active secoisolariciresinol that is synthesized from pinoresinol via lariciresinol. Key enzymes involved in the synthesis of this lignans are two isoforms of pinoresinol-lariciresinol reductases with opposite enantiospecificity. The action of bifunctional reductase does not allow for an explanation for the accumulation of lariciresinol and its derivates in seeds, stem and cell suspension. To try and better understand complex lignan profile we report expression and activity of two new putative PLRs, LuPLR3 and LuPLR4. LuPLR4 in vitro acts only as pinoresinol reductase what has only been seen in Brassicaceae family until now. Lignans play a role in plant defense. All PLRs are upregulated following Fusarium oxysporum attack, a common flax pathogen. Promoter deletions and mutation evidenced region involved in regulation of LuPLR1 gene response to Fusarium. The region contains several W boxes, putative binding sites for WRKY transcription factors. WRKY transcription factors play a role in response to biotic and abiotic stress. We have isolated LuWRKY36 from two cell suspension treated with Fusarium oxysporum or abscisic acid. Gel-shift assay and DPI-ELISA showed binding of LuWRKY36 to W box present in the LuPLR1 gene promoter. This regulation was also confirmed in vivo. We also report the differential impact of F. oxysporum elicitation on LuWRKY36 and LuPLR1 gene expression and secoisolariciresinol production in flax cultivars Barbara (Fusarium sensitive) and Baikal (Fusarium tolerant). Many beneficial effects of secoisolariciresinol and other phenolic compounds found in flax require “green” extraction and sometimes targeted purification of a specific compound. We report here that natural deep eutectic solvents using ultrasound assisted extraction can extract phenolic compounds from flax seed coat and that results indicate that by tuning different parameters of extraction we can target purification of desired plant product.