Duisburg, Essen, Universiẗat, Diss., 2004.

Thesis (doctoral)--University, Tel Aviv, 2002.

The infection of a eukaryotic host cell by a bacterial pathogen is one of the most intimate examples of cross-kingdom interactions in biology. Infection processes are highly relevant from both a basic research as well as a clinical point of view. Sophisticated mechanisms have evolved in the pathogen to manipulate the host response and vice versa host cells have developed a wide range of anti-microbial defense strategies to combat bacterial invasion and clear infections. However, it is this diversity and complexity that makes infection research so challenging to technically address as common approaches have either been optimized for bacterial or eukaryotic organisms. Instead, methods are required that are able to deal with the often dramatic discrepancy between host and pathogen with respect to various cellular properties and processes. One class of cellular macromolecules that exemplify this host-pathogen heterogeneity is given by their transcriptomes: Bacterial transcripts differ from their eukaryotic counterparts in many aspects that involve both quantitative and qualitative traits. The entity of RNA transcripts present in a cell is of paramount interest as it reflects the cell’s physiological state under the given condition. Genome-wide transcriptomic techniques such as RNA-seq have therefore been used for single-organism analyses for several years, but their applicability has been limited for infection studies. The present work describes the establishment of a novel transcriptomic approach for infection biology which we have termed “Dual RNA-seq”. Using this technology, it was intended to shed light particularly on the contribution of non-protein-encoding transcripts to virulence, as these classes have mostly evaded previous infection studies due to the lack of suitable methods. The performance of Dual RNA-seq was evaluated in an in vitro infection model based on the important facultative intracellular pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium and different human cell lines. Dual RNA-seq was found to be capable of capturing all major bacterial and human transcript classes and proved reproducible. During the course of these experiments, a previously largely uncharacterized bacterial small non-coding RNA (sRNA), referred to as STnc440, was identified as one of the most strongly induced genes in intracellular Salmonella. Interestingly, while inhibition of STnc440 expression has been previously shown to cause a virulence defect in different animal models of Salmonellosis, the underlying molecular mechanisms have remained obscure. Here, classical genetics, transcriptomics and biochemical assays proposed a complex model of Salmonella gene expression control that is orchestrated by this sRNA. In particular, STnc440 was found to be involved in the regulation of multiple bacterial target mRNAs by direct base pair interaction with consequences for Salmonella virulence and implications for the host’s immune response. These findings exemplify the scope of Dual RNA-seq for the identification and characterization of novel bacterial virulence factors during host infection. / Die Infektion einer eukaryontischen Wirtszelle mit einem bakteriellen Pathogen ist eines der komplexesten Beispiele einer Domänen-überschreitenden Wechselwirkung zweier Organismen. Infektionsprozesse sind in höchstem Maße relevant, sowohl in der Grundforschung als auch von einem klinischen Blickwinkel aus betrachtet. Im Laufe der Evolution entstanden komplizierte Mechanismen, die es einem Pathogen erlauben, die Wirtsantwort zu manipulieren. Umgekehrt haben potentielle Wirtszellen eine Reihe von anti-mikrobiellen Verteidigungsstrategien entwickelt, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen und letztlich zu beseitigen. Es sind jedoch genau diese Verschiedenheit und Komplexität, welche die Infektionsforschung so anspruchsvoll und technisch schwer analysierbar machen. Gängige Analysemethoden wurden zumeist entweder für bakterielle oder aber eukaryontische Organismen entwickelt. Dagegen werden Techniken benötigt, welche es erlauben, mit den mitunter extremen Unterschieden zwischen Wirt und Pathogen umzugehen, die sich in etlichen zellulären Eigenschaften und Prozessen manifestieren. Eine Klasse zellulärer Makromoleküle, die diese Heterogenität zwischen Wirt und Pathogen widerspiegelt, sind ihre jeweiligen Transkriptome: Bakterielle Transkripte unter-scheiden sich von ihren eukaryontischen Pendants in vielerlei Hinsicht, was sowohl quantitative als auch qualitative Aspekte miteinschließt. Die Gesamtheit zellulärer Transkripte ist von größter Bedeutung, da sie den physiologischen Zustand der jeweiligen Zelle unter den gegebenen Bedingungen reflektiert. Aus diesem Grund werden Genom-weite Transkriptom-techniken wie etwa die RNA-Sequenzierung seit etlichen Jahren erfolgreich angewandt, um biologische Prozesse zu untersuchen – jedoch ist deren Eignung für Infektionsstudien in starkem Maße limitiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Etablierung eines neuartigen Ansatzes, „Duale RNA-Sequenzierung“ genannt, der Transkriptomstudien mit der Infektionsbiologie kompatibel macht. Mithilfe dieser Technologie wurde hier im Besonderen versucht, die Rolle nicht-proteinkodierender RNA-Moleküle für die Virulenz zu beleuchten, da die Charakterisierung dieser RNA-Klassen bisherigen Infektionsstudien weitgehend verwehrt blieb. Die Anwendbar-keit der Dualen RNA-Sequenzierung wurde innerhalb eines In-vitro-Infektionsmodells getestet, welches auf dem wichtigen, fakultativ intrazellulären Pathogen Salmonella enterica serovar Tyhimurium und verschiedenen humanen Zelllinien basiert. Die Duale RNA-Sequenzierung zeigte sich dabei in der Lage alle wesentlichen bakteriellen sowie humanen Transkriptklassen zu erfassen und erwies sich als reproduzierbar. Im Zuge dieser Experimente wurde ein Gen für eine zuvor kaum beschriebene kleine nicht-kodierende RNA (STnc440) als eines der am stärksten induzierten Gene intrazellulärer Salmonellen identifiziert. Interessanterweise hatten vorherige Studien gezeigt, dass die Inaktivierung dieses Gens zu einem Virulenzdefizit innerhalb unterschiedlicher Tiermodelle für Salmonellose führt. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen blieben jedoch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische, Transkriptom- sowie biochemische Analysen eingesetzt um das komplexe Regulationsnetzwerk dieser kleinen RNA erstmals näher zu beleuchten. Im Einzelnen konnte gezeigt werden, dass STnc440 die Expression mehrerer bakterieller mRNAs durch das Ausbilden zwischen-molekularer Basenpaarungen reguliert, was weitreichende Konsequenzen sowohl für die Virulenz des Pathogens als auch die Immunantwort des Wirts hat. Diese Ergebnisse veranschaulichen das Potential der Dualen RNA-Sequenzierung für das Auffinden und Charakterisieren neuer bakterieller Virulenzfaktoren während der Wirtsinfektion.

Staphylococcus aureus is both a human commensal and a pathogen. 20%-30% of all individuals are permanently or occasionally carriers of S. aureus without any symptoms. In contrast to this, S. aureus can cause life-threatening diseases e.g. endocarditis, osteomyelitis or sepsis. Here, the increase in antibiotic resistances makes it more and more difficult to treat these infections and hence the number of fatalities rises constantly. Since the pharmaceutical industry has no fundamentally new antibiotics in their pipeline, it is essential to better understand the interplay between S. aureus and the human host cell in order to find new, innovative treatment options. In this study, a RNA interference based whole genome pool screen was performed to identify human proteins, which play a role during S. aureus infections. Since 1,600 invasion and 2,271 cell death linked factors were enriched at least 2 fold, the big challenge was to filter out the important ones. Here, a STRING pathway analysis proved to be the best option. Subsequently, the identified hits were validated with the help of inhibitors and a second, individualised small interfering RNA-based screen. In the course of this work two important steps were identified, that are critical for host cell death: the first is bacterial invasion, the second phagosomal escape. The second step is obligatory for intracellular bacterial replication and subsequent host cell death. Invasion in turn is determining for all following events. Accordingly, the effect of the identified factors towards these two crucial steps was determined. Under screening conditions, escape was indirectly measured via intracellular replication. Three inhibitors (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) could be identified for the invasion process. In addition, siRNAs targeted against 16 different genes (including CAPN2, CAPN4 and PIK3CG), could significantly reduce bacterial invasion. Seven siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) were able to inhibit intracellular replication significantly. Further studies showed that the IP3 receptor inhibitor 2-APB, the calpain inhibitor calpeptin and the proteasome inhibitor MG-132 are able to prevent phagosomal escape and as a consequence intracellular replication and host cell death. In this context the role of calpains, calcium, the proteasome and the mitochondrial membrane potential was further investigated in cell culture. Here, an antagonistic behaviour of calpain 1 and 2 during bacterial invasion was observed. Intracellular calcium signalling plays a major role, since its inhibition protects host cells from death. Beside this, the loss of mitochondrial membrane potential is characteristic for S. aureus infection but not responsible for host cell death. The reduction of membrane potential can be significantly diminished by the inhibition of the mitochondrial Na+/Ca2+ exchanger. All together, this work shows that human host cells massively contribute to different steps in S. aureus infection rather than being simply killed by bacterial pore-forming toxins. Various individual host cell factors were identified, which contribute either to invasion or to phagosomal escape and therefore to S. aureus induced cytotoxicity. Finally, several inhibitors of S. aureus infection were identified. One of them, 2-APB, was already tested in a sepsis mouse model and reduced bacterial load of kidneys. Thus, this study shows valuable evidence for novel treatment options against S. aureus infections, based on the manipulation of host cell signalling cascades. / Staphylococcus aureus kann sowohl ein Bestandteil der natürlichen Hautflora als auch ein Krankheitserreger sein. 20%-30% aller Menschen werden, permanent oder zeitweise, von S. aureus besiedelt, ohne Krankheitssymptome aufzuweisen. Im Gegensatz dazu kann S. aureus lebensbedrohliche Krankheiten wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Sepsis verursachen. Diese Infektionen können immer schlechter behandelt werden, da immer mehr Stämme Resistenzen gegen die vorhandenen Antibiotika aufweisen. Dies führt zu einer steigenden Anzahl an Todesfällen, die auf Staphylokokkeninfektionen zurückzuführen sind. Da die Pharmaindustrie keine grundlegend neuen Antibiotika kurz vor der Marktreife hat, ist ein besseres Verständnis für das Wechselspiel zwischen Staphylokokken und ihren menschlichen Wirtszellen unbedingt notwendig, um neue, innovative Behandlungsmöglichkeiten finden zu können. Dafür wurde in dieser Arbeit ein genomweiter RNA-interferenz basierter Screen durchgeführt. Es sollten so die Proteine identifiziert werden, die eine Rolle bei der Staphylokokkeninfektion spielen. Da 1.600 invasionsrelevante und 2.271 zelltodrelevante Faktoren mindestens 2-fach angereichert waren, musste ein Weg gefunden werden die wichtigen Faktoren herauszufiltern. Eine STRING-Pathwayanalyse stellte sich als die beste Methode hierfür heraus. In einem zweiten Schritt wurden die so identifizierten Faktoren mit Inhibitoren oder einzelnen siRNAs ein weiteres Mal herunterreguliert, um ihre tatsächlichen Auswirkungen auf den Infektionsverlauf zu untersuchen. Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dem S. aureus induzierten Wirtszelltod mindestens zwei wichtige Schritte vorausgehen müssen. Erstens die Invasion der Wirtszelle und zweitens der Ausbruch aus dem Phagosom. Nur so können sich im dritten Schritt die Bakterien intrazellulär vermehren und die Zelle töten. Daher wurde der Einfluss der identifizierten Faktoren auf diese beiden entscheidenden Prozesse untersucht. Der Ausbruch wurde unter Screenkonditionen indirekt über die intrazelluläre Vermehrung bestimmt. Es konnten drei Inhibitoren (JNKII, Methyl-beta-cyclodeytrin, 9-Phenantrol) identifiziert werden, die die bakterielle Invasion vermindern. Darüber hinaus wurden 16 Proteine (unter anderem CAPN2, CAPN4 und PIK3CG) gefunden, deren Herunterregulation durch siRNAs, eine signifikant reduzierte Invasion zur Folge hatten. Sieben siRNAs (FPR2, CAPN4, JUN, LYN, HRAS, AKT1, ITGAM) waren in der Lage die intrazelluläre Vermehrung signifikant zu verringern. In nachfolgenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass der IP3-Rezeptorinhibitor 2-APB, der Calpaininhibitor Calpeptin und der Proteasominhibitor MG-132 den Ausbruch aus dem Phagosom, sowie die darauffolgenden Ereignisse (intrazelluläre Vermehrung und Wirtszelltod) inhibieren können. In diesem Zusammenhang wurden die Einflüsse von Calpainen, Calcium, dem Proteasom sowie dem mitochondrialen Membranpotentialverlust im Zellkulturmodell im Detail weiter untersucht. So konnte eine gegensätzliche Rolle von Calpain 1 und 2 bei der S. aureus Invasion festgestellt werden. Die intrazelluläre calciumabhängige Signalweiterleitung spielt eine bedeutende Rolle bei der S. aureus Infektion, da ihre Inhibition eine normale Infektion verhindert. Das mitochondriale Membranpotential (MMP) sinkt während einer S. aureus infektion, ist aber nicht für den Zelltod verantwortlich. Das Sinken des MMPs kann mit einem Inhibitor, der den mitochondrialen Na+/Ca2+ Austausch verhindert, signifikant reduziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die menschliche Wirtszelle selbst relevant zu den verschiedenen Schritten der Staphylokokkeninfektion beiträgt, und nicht einfach, wie häufig angenommen, von porenbildenden bakteriellen Toxinen zerstört wird. Entsprechend konnten einzelne Wirtszellproteine identifiziert werden, die entweder zur bakteriellen Invasion oder zum phagosomalen Ausbruch und somit zum induzierten Wirtszelltod beitragen. Überdies konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren, die diese Wirtszellproteine hemmen, die Wirtszellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten vor einer S. aureus Infektion schützen können. Folglich liefert diese Arbeit wertvolle Hinweise für neue Behandlungsmöglichkeiten von S. aureus Infektionen, die auf der Manipulation von Wirtszellsignalkaskaden beruhen.

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2009

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Staphylococcus aureus is a Gram-positive commensal bacterium, that asymptomatically colonizes human skin and mucosal surfaces. Upon opportune conditions, such as immunodeficiency or breached barriers of the host, it can cause a plethora of infections ranging from local, superficial infections to life-threatening diseases. Despite being regarded as an extracellular pathogen, S. aureus can invade and survive within non-phagocytic and phagocytic cells. Eventually, the pathogen escapes from the host cell resulting in killing of the host cell, which is associated with tissue destruction and spread of infection. However, the exact molecular mechanisms underlying S. aureus-induced host cell death remain to be elucidated. In the present work, a genome-wide haploid genetic screen was performed to identify host cell genes crucial for S. aureus intracellular cytotoxicity. A mutant library of the haploid cell line HAP1 was infected with the pathogen and cells surviving the infection were selected. Twelve genes were identified, which were significantly enriched when compared to an infection with a non-cytotoxic S. aureus strain. Additionally, characteristics of regulated cell death pathways and the role of Ca2+ signaling in S. aureus-infected cells were investigated. Live cell imaging of Ca2+ reporter cell lines was used to analyze single cells. S. aureus-induced host cell death exhibited morphological features of apoptosis and activation of caspases was detected. Cellular H2O2 levels were elevated during S. aureus intracellular infection. Further, intracellular S. aureus provoked cytosolic Ca2+ overload in epithelial cells. This resulted from Ca2+ release from endoplasmic reticulum and Ca2+ influx via the plasma membrane and led to mitochondrial Ca2+ overload. The final step of S. aureus-induced cell death was plasma membrane permeabilization, a typical feature of necrotic cell death. In order to identify bacterial virulence factors implicated in S. aureus-induced host cell killing, the cytotoxicity of selected mutants was investigated. Intracellular S. aureus employs the bacterial cysteine protease staphopain A to activate an apoptosis-like cell death characterized by cell contraction and membrane bleb formation. Phagosomal escape represents a prerequisite staphopain A-induced cell death, whereas bacterial intracellular replication is dispensable. Moreover, staphopain A contributed to efficient colonization of the lung in a murine pneumonia model. In conclusion, this work identified at least two independent cell death pathways activated by intracellular S. aureus. While initially staphopain A mediates S. aureus-induced host cell killing, cytosolic Ca2+-overload follows later and leads to the final demise of the host cell. / Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives, kommensales Bakterium, welches menschliche Haut- und Schleimhautoberflächen asymptomatisch kolonisiert. Unter günstigen Bedingungen, wie z. B. Immunschwäche oder verletzten Barrieren des Wirtes, kann es eine Vielzahl von Infektionen verursachen, die von lokalen, oberflächlichen Infektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Krankheiten reichen. Obwohl S. aureus als extrazellulärer Erreger angesehen wird, kann das Bakterium von nicht-phagozytischen und phagozytischen Zellen aufgenommen werden und dort überleben. Schließlich bricht das Pathogen aus der Wirtszelle aus und die damit einhergehende Tötung der Wirtszelle wird mit Gewebezerstörung und Ausbreitung der Infektion in Verbindung gebracht. Die genauen molekularen Mechanismen, die dem S. aureus induzierten Wirtszelltod zugrunde liegen, müssen jedoch noch geklärt werden. In dieser Arbeit wurde ein genomweiter haploid genetischer Screen durchgeführt, um Wirtszellgene zu identifizieren, die für die intrazelluläre Zytotoxizität von S. aureus entscheidend sind. Eine Mutantenbibliothek der haploiden Zelllinie HAP1 wurde mit dem Erreger infiziert und die Zellen, die die Infektion überlebten, wurden selektiert. Dabei wurden zwölf Gene identifiziert, die signifikant angereichert waren gegenüber einer Infektion mit einem nicht-zytotoxischen S. aureus Stamm. Des Weiteren wurden Eigenschaften regulierter Zelltod-Signalwege und die Rolle der Ca2+-Signalübertragung in S. aureus infizierten Zellen untersucht. Lebendzellbildgebung von Ca2+-Reporterzelllinien wurde zur Analyse von einzelnen Zellen eingesetzt. Der S. aureus induzierte Wirtszelltod wies morphologische Merkmale von Apoptose auf und die Aktivierung von Caspasen wurde nachgewiesen. Der zelluläre H2O2-Spiegel wurde durch die intrazelluläre Infektion mit S. aureus erhöht. Zusätzlich rief der intrazelluläre S. aureus eine zytosolische Ca2+-Überbelastung in Epithelzellen hervor. Dies resultierte aus der Ca2+-Freisetzung vom endoplasmatischen Retikulum und dem Einstrom von Ca2+ über die Plasmamembran und führte zu einer mitochondrialen Ca2+-Überbelastung. Der finale Schritt des durch S. aureus induzierten Zelltods war die Permeabilisierung der Plasmamembran, ein typisches Merkmal des nekrotischen Zelltods. Um bakterielle Virulenzfaktoren zu identifizieren, die am S. aureus-induzierten Wirtszelltod beteiligt sind, wurde die Zytotoxizität von ausgewählten Mutanten untersucht. Der intrazelluläre S. aureus nutzt die bakterielle Cysteinprotease Staphopain A, um einen Apoptose-artigen Zelltod zu aktivieren, der durch Zellkontraktion und Blasenbildung der Membran gekennzeichnet ist. Der phagosomale Ausbruch stellt eine Voraussetzung für den Staphopain A-induzierten Zelltod da, während die intrazelluläre Replikation der Bakterien nicht notwendig ist. Darüber hinaus trug Staphopain A zu einer effizienten Kolonisation der Lunge in einem murinen Pneumonie-Modell bei. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit mindestens zwei unabhängige Zelltod-Signalwege identifiziert hat, die durch den intrazellulären S. aureus aktiviert werden. Während zunächst Staphopain A den Tod der Wirtszelle einleitet, folgt später die zytosolische Ca2+-Überlastung und führt zum endgültigen Untergang der Wirtszelle.