Mit der Entdeckung der katalytischen Aktivität von Ribonukleinsäuren wurde begonnen, darauf basierende therapeutische Strategien zu entwickeln, die auf genetischer Ebene den Stoffwechsel oder virale Infektionen von Zellen beeinflussen. Entsprechende Oligoribonukleotide waren befähigt, spezifisch RNA-Stränge zu erkennen und zu spalten. In Analogie zu Enzymen wurden sie als Ribozyme bezeichnet. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines metabolisch stabilen Hammerhead-Ribozyms. Dieses sollte lipidvermittelt in die Zellen des Nierenzellkarzinoms RCC 95/96 transfiziert werden und dort die Genexpression des dem Parathormon verwandten Proteins (PTHrP) durch die Spaltung der PTHrP-mRNA unterdrücken. Ausgangspunkt der Entwicklung war das Hammerhead-Ribozym RbO. Es wies in zellfreien Versuchen bei der Spaltung einer 232 Basen langen Substrat-RNA mit einem k(obs)-Wert von 47,42 E-3 /min eine zur Literatur vergleichbar hohe Aktivität auf, jedoch zeigte es sich als reiner RNA-Strang gegenüber Nukleasen sehr fragil. Das Endprodukt der in mehreren Schritten abgelaufenen Weiterentwicklung des Ribozyms RbO stellte das Ribozym RbS dar. Im Vergleich zum Ausgangsribozym bestand das in der Stammschleife verkürzte Ribozym zu 71 % aus DNA. Es besaß Phosphorothioatmodifi-kationen in den Flanken und in den konservierten Sequenzbereichen. Zudem war durch einen Basenwechsel im katalytischen Teil der Stammschleife eine Pyrimidinbase durch eine Purinbase ausgetauscht worden. Zu-sammen bedingten die genannten Veränderungen eine Steigerung der Ribozymstabilität um mehr als das Zehnfache. Dabei war die katalytische Aktivität des Ribozyms RbS mit einem k(obs)-Wert von 45,76 E-3 /min gegenüber RbO annähernd identisch. Das schrittweise Vorgehen bei der Ribozymentwicklung mit dem Erstellen von 20 unterschiedlich modifi-zierten Ribozymen ermöglichte es, den Einfluss einzelner Modifikationen auf die Ribozymaktivität zu prüfen. Mehrfach konnten dabei die Ergebnisse anderer Forschungsgruppen bestätigt werden. So wurde erkannt, dass für viele Modifikationen, wie Ribozymverkleinerung, RNA-DNA-Basenaustausch und Phosphorothioa-teinbindung, die Auswirkung auf die katalytische Aktivität nur begrenzt vorherzusagen ist und optimale Er-gebnisse nur durch Testreihen zu erlangen sind. Bei der Behandlung der Tumorzellen in Monolayer-Zellkultur ließ sich für das Ribozym RbS keine signifi-kante Wirkung nachweisen. Als Ursache dafür ist am ehesten die auf Grund von Sekundärstrukturen fehlende Erkennung der Zielsequenz innerhalb der PTHrP-mRNA anzunehmen. / The development of therapeutic strategies affecting cellular metabolism and viral infections of cells was in-troduced after the discovery of the catalytic activity of ribonucleic acid. Appropriate oligoribonucletides were able to specificly recognize and cleave RNA strands. They were called ribozymes by analogy with enzymes. The main task of our research was the development of a metabolic stable hammerhead ribozym. The ribozym should be transfected by lipid mediated transport into renal carcinoma cells RCC 95/96 where it should suppress the gene expression of parathormone-related peptide (PTHrP) by means of cleavage of the PTHrP mRNA. The hammerhead ribozyme RbO was the starting point of the development. Its activity in cleavage of 232 base long subsrats in cell-free tests was comparable to the literature (k(obs) value 47,42 E-3 /min). However it was very fragile regarding nucleases. The end product of the gradual further develop-ment of the ribozyme RbO was the ribozyme RbS. This ribozyme which was shortened in helix 2 consisted of 71 percent DNA in comparison to the original one. It was modified with phosphorothioates in helix 1 and 3 and in the conserved sequence regions. Furthermore a pyrimidine base was exchanged for a purine base in the catalytic part of helix 2. Altogether the named alterations increased the stability of the ribozyme more than 10 times. The catalytic activity of the ribozyme RbS compared to RbO was approximately identical (k(obs) value 45,76 E-3 /min). The step-by-step development of the ribozymes with the creation of 20 different modified ribozyms made it possible to study the impact of individual modifications on the ribozyme activity. Often the results of other research groups were confirmed. Thus it was detected that the effects of some modifications like ribozyme reduction, RNA-DNA base exchange and phosphorothioates integration are only partly predictable. Therefo-re optimal results are only obtained by a number of tests. Finally we could not demonstrate a significant effect of the ribozyme RbS in the treatment of tumor cells in monolayer. The most likely explanation for this seems to be that the target sequence inside of the PTHrP-mRNA wasn't recognized due to secondary structures.

Die Zytokine Interleukin-2 und Interferon-a2a nehmen eine zentrale Stellung bei der Behandlung von Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen ein. Im klinischen Teil der Arbeit wurde die Effektivität der Chemoimmuntherapie monozentrisch an 107 Patienten untersucht. Es zeigte sich eine Rate objektiver Remissionen von 22 % (95 % CI 14,6 - 31,3 %) mit einer zusätzlichen Rate an vorübergehenden Stabilisierungen von 46 %. Das mediane Überleben lag bei 19 Monaten mit einer kalkulierten 5-Jahres-Überlebensrate von 17 %. In der multivariaten Analyse zeigte sich eine hochsignifikante Abhängigkeit vom Karnofsky-Performance-Index der Patienten. Bei den 83 Patienten mit einem Karnofsky-Performance-Index von über 80 % lag das mediane Überleben bei 23 Monaten mit einer kalkulierten 5-Jahres-Überlebensrate von 21 %. Diese Untersuchungsergebnisse rechtfertigen eine weitere Prüfung der Kombination von Interleukin-2, Interferon-a2a und 5-Fluorourazil im Rahmen prospektiver klinischer Studien. In Weiterentwicklung der klinischen Aspekte zur Zytokin-basierten Immuntherapie war es die Aufgabenstellung des experimentellen Teils dieser Arbeit, die Bedeutung von 70 kDa Hitzeschockproteinen (HSP70) beim Nierenzellkarzinom zu untersuchen. Neben ihrer Funktion im Rahmen der zellulären Stressverarbeitung haben Mitglieder der HSP70-Familie (HSP72 und HSP73) eine außerordentliche Bedeutung für tumorimmunologische Fragestellungen erlangt, die sich aus der immunologischen Signalfunktion, der HSP72-vermittelten Interaktion von immunologischen Effektorzellen und Tumorzellen und der Beteiligung von HSP70 an der Peptidprozessierung in malignen Zellen ergeben. An einer Nierenkarzinomzelllinie und an Primärzellen von Nierenkarzinomen konnte die HSP72-Oberfächenexpression durchflusszytometrisch auf der Tumorzelloberfläche nachgewiesen und an der Zelllinie mit einer erhöhten Lyse der Tumorzellen durch Interleukin-2 stimulierte NK-Zellen korreliert werden. Im Gegensatz zu bisherigen Literaturbefunden zeigte sich in diesem Modell jedoch, dass die Membranexpression von HSP72 nicht nur auf maligne Zellen beschränkt, sondern auch bei renalen Zellen aus Normalgewebe nachzuweisen war. In einer immunhistochemischen Studie zur basalen, zytoplasmatischen HSP72-Expression zeigte sich univariat eine signifikante Korrelation einer hohen HSP72-Expression und dem Überleben der Patienten. In einer multivariaten Analyse konnte das Ausmaß der HSP72-Expression als unabhängiger prognostischer Parameter identifiziert werden, der auch mit dem Ansprechen auf eine Chemoimmuntherapie korreliert. Die klinische Etablierung spezifisch wirksamer Vakzinen nimmt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden des metastasierten Nierenzellkarzinoms ein. Dabei spielen Vakzinen auf der Basis von HSP-Peptid-Vakzinen eine besondere Rolle. Ein weiterer Bestandteil der experimentellen Arbeiten war daher in der Entwicklung einer Methode zur Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen. Mit der ADP-Affinitätschromatographie konnte eine Methode zur Anwendung gebracht und patentiert werden, durch die sich HSP70-Peptid-Komplexe aus Tumorzellen anreichern lassen. Die HSP70-Peptid-Komplexe sind einerseits für HSP-basierte Vakzinekonzepte verfügbar oder können andererseits für die Identifikation und Charakterisierung HSP70-gebundenener biologisch-aktiver (immunogener) Peptide genutzt werden. Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse demonstrieren, dass HSP72 per se eine prognostische Bedeutung beim Nierenzellkarzinom besitzt und weisen auf die potentielle Bedeutung von HSP72 als immunologische Zielstruktur hin. Die Resultate stellen neue Ansätze zum tieferen Verständnis der immunogenen Eigenschaften des Nierenzellkarzinoms dar und liefern Ausgangspunkte für die Etablierung innovativer Vakzinationskonzepte bei der Behandlung des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms. / The cytokines interleukin-2 and interferon-a2a are of central importance in the treatment of patients with metastatic renal cell cancer. In the clinical part of the thesis the efficacy of chemoimmunotherapy was investigated monocentrically on 107 patients. It appeared a rate of objective remissions of 22% (95% CI 14.6 - 31.3%) and an additional rate of temporary disease stabilisations of 46%. The median survival was 19 months, with a calculated 5-year survival rate of 17%. Multivariate analysis revealed a highly significant dependence on the Karnofsky-Performance-Index of the patients. In 83 patients with Karnofsky-Performance-Index over 80% the median survival was 23 months, with a calculated 5-year survival of 21%. These results justify the further investigation of the combination of interleukin-2, interferon-a2a, and 5-fluorouracil in prospective clinical studies. In the context of the clinical aspects of cytokine-based immunotherapy it was the task of the the experimental part of the study to investigate the importance of 70 kDa heat shock proteins (HSP70) in renal cell cancer. Besides their function in cellular stress processing, members of the HSP70 family (HSP72 and HSP73) are especially important for answering questions of tumor immunology resulting from their immunological signal function, the HSP72-mediated interaction of immunological effector cells with tumor cells, and from the involvement of HSP70 in peptide processing in malignant cells. On the basis of a renal cancer cell line and of primary cells of renal carcinomas the HSP72 expression on the surface of tumor cells could be demonstrated by flow cytometry and correlated with an increased lysis of tumor cells on the cell line by interleukin-2 stimulated natural killer cells. In contrast to the findings so far reported in the literature, the present model revealed that the membrane expression of HSP72 was not limited to malignant cells but was detectable in renal cells of normal tissue too. In an immunohistochemical study on basal cytoplasmatical HSP72 expression, a univariate analysis showed a significant correlation of high HSP72 expression and patient survival. In a multivariate analysis the extent of the HSP72 expression could be identified as an independent prognostic parameter that was also correlated with the response of patients to chemoimmunotherapy. The clinical establishment of specifically effective vaccines plays a central part in the development of new treatment strategies for metastatic renal cell cancer. In this context, vaccines on the basis of HSP-peptides are of special interest. Therefore, the experimental part of the work was also aimed at developing a method for enriching HSP70-peptide complexes. With ADP affinity chromatography a method for concentrating HSP70-peptide complexes from tumor cells was created, which proved to be usable and was patented. On the one hand, HSP70-peptide complexes can be used for HSP-based vaccine programmes, on the other hand, they can serve for identifying and characterizing HSP70-bound biologically active (immunogenic) peptides. The present findings demonstrate that HSP72 per se has a prognostic value in renal cell cancer and point to the potential importance of HSP72 as an immunological target structure. The results represent new approaches to a deeper understanding of the immunological properties of renal cell carcinoma and give a basis from which to establish innovative vaccination programmes for the treatment of advanced renal cell carcinoma.