Derzeit gibt es keine wirksame Therapie gegen das maligne Melanom. Der Todesligand TRAIL erscheint als eine vielversprechende Krebstherapie. Trotzdessen weisen Melanomzellen sowohl eine bestehende als auch induzierbare TRAIL-Resistenz auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die Überwindung der TRAIL-Resistenz durch drei Kinaseinhibitoren untersucht.Das Indirubin-Derivat 8-Rha-β ist in der Lage, die Sensitivität von Melanomzellen für die Todesliganden zu erhöhen und die Resistenz für TRAIL und CD95-Agonisten zu überwinden. Die Behandlung mit 8-Rha-β vermittelt sowohl die Aktivierung des extrinsischen als auch intrinsischen Signalweges. Der Tumorsuppressor p53 zeigte sich als Hauptregulator dieser proapoptotischen Änderungen und ist der Transaktivator der proapoptotischen Proteine, welche durch das 8-Rha-β heraufreguliert wurden. Die Anwendung eines Melanommodells von TRAIL-sensitiven und resistenten Zelllinien konnte eine Sensitivierung für TRAIL mittels des Kinaseinhibitors BMS-345541 aufzeigen. Die Behandlung von BMS-345541 resultierte alleine in einer frühen Bax-Aktivierung, was in den Konformationsänderungen, veränderten Phosphorylierungen und der Translokation von Bax beobachtet werden konnte. Die synergistischen Effekte resultierten aus der Aktivierung von Bid durch TRAIL, welches Bcl-2 inhibiert und der Aktivierung von Bax durch BMS-345541. Mutiertes BRAF wurde als der kritische Faktor für das kutane Melanom identifiziert. In dieser Arbeit wird ein pan-RAF-Inhibitor, L-779,450, verwendet. Dieser Inhibitor sensitiviert ebenfalls für eine TRAIL-induzierte Apoptose. Die Apoptose war mit der Aktivierung des intrinsischen Signalweges verbunden. L-779,450 allein induziert keine Apoptose, aber resultiert in einer Aktivierung von Bax und der Hochregulation von Bim. Die hier identifizierten Kinaseinhibitoren könnten bei der Behandlung des malignen Melanoms helfen, um die TRAIL-Resistenz zu überwinden und die Wirksamkeit TRAIL-vermittelter Therapieformen zu optimieren. / Until today efficient therapies are lacking for metastatic melanoma. The death ligand TRAIL appears as promising in cancer treatment; however, melanoma cells reveal both preexisting and inducible TRAIL resistance. In the present study the mechanisms of TRAIL-induced apoptosis by three kinase inhibitors were investigated. The indirubin derivative 8-Rha-β is able to enhance melanoma cell sensitivity for death ligands and overcomes resistance to TRAIL and CD95 agonists. Indirubin activated the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways. The tumor suppressor p53 by its ability to transactivate proapoptotic proteins appeared as master regulator of these proapoptotic changes which was upregulated by indirubin. Applying a melanoma model of TRAIL-sensitive and resistant cell lines, efficient sensitization for TRAIL is demonstrated for the kinase inhibitor BMS-345541. Of note, BMS-345541 alone resulted in early Bax activation, seen by conformational changes, altered Bax phosphorylation and Bax translocation. The synergistic effects resulted from Bid activation in response to TRAIL, which inhibits Bcl-2, and the activation of Bax through BMS-345541. Mutated BRAF represents a critical oncogene in melanoma. Here, we investigated effects of the pan-RAF inhibitor L-779,450, which resulted in strong enhancement of apoptosis in combination with TRAIL. Apoptosis coincided with activation of mitochondrial pathways. Apoptosis induction by L-779,450/TRAIL was dependent on Bax. Thus, activation of Bax by L-779,450 alone was demonstrated by Bax conformational changes. Furthermore, the BH3-only protein Bim was upregulated in response to L-779,450. This identified specific role of these kinase inhibitors, which are able to enhance melanoma cell sensitivity for TRAIL could be helpful for treatment of malignant melanoma to overcome the TRAIL-resistance and to optimize the efficiency of recent therapies.

Mit klonspezifischer Polymerasekettenreaktion (PCR) ist ein spezifischer Nachweis kleiner DNA-Mengen möglich. Von 47 MF-Patienten wurden aus Hautproben 50 TCR-gamma- und 7 TCR-beta-Sequenzen sequenziert, von 15 bzw. 5 Patienten gelang die Entwicklung eines N-spezifischen Primers. Um einen Zusammenhang zwischen Frequenz der zirkulierenden klonalen Zellen und klinischem Verlauf zu untersuchen, wurden für 4 Patienten im LightCycler die im Blut zirkulierenden klonalen Rearrangements quantifiziert. Ein Vergleich dieser Daten mit dem klinischen Verlauf ergab bei zwei Patienten eine Tendenz zu einem reziproken Verhältnis, bei einem Patienten im Tumorstadium wurde eine gleichsinnige Entwicklung beider Parameter gesehen. Der Nachweis klonaler Rearrangements in Haut- und Blutproben von SPP-Patienten wäre ein Hinweis auf den Lymphomcharakter dieser Erkrankung. Bei 9 von 14 SPP-Patienten wurde in Blutproben mit Hilfe der für VgammaI-Jgamma1/2 spezifischen Konsensusprimer ein monoklonales Rearrangement gefunden. Für 6 Patienten konnte ein klonspezifischer Primer entwickelt werden. Ein Nachweis der klonalen Sequenz aus dem Blut in der Haut war trotz einer geschachtelten PCR nicht möglich. / By clone specific polymerase chain reaction (pcr) small amounts of DNA can be detected. We discovered 50 tcr gamma and 7 tcr beta sequences from skin probes of 47 patients with mycosis fungoides. From 15 respectively 5 patients n-specific primers were designed. In order to examine if there is a relation between frequency of circulating clonal cells and clinical course, for 4 patients circulating clonal cells were quantified by real time pcr in LightCycler. In two patients we saw a reciproce proportion, in one patient with tumourstage disease rising numbers of circulating clonal cells were seen during worsening of clinical course. Detection of clonal rearrangments in skin and blood probes of patients with small plaque parapsoriasis could be a hint for classifying SPP as a lymphoma. In 6/14 patients we designed a clone-specific primer for circulating clonal rearangments. Despite performing a nested pcr circulating clonal rearrangments could not be detected in skin lesions of these patients.