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Estudos estruturais de enzimas da via de biossíntese de folatos de Xanthomonas albilineans para o desenvolvimento de novos candidatos a agroquímicos para a cultura de cana-de-açúcar / Structural studies of folate biosynthesis pathway enzymes from Xanthomonas albilineans for the development of new agrochemical candidates for sugarcane cropLima, Gustavo Machado Alvares de 22 September 2017 (has links)
O destaque da cana-de-açúcar como fonte de energia renovável tem motivado a busca por melhorias no processo de cultivo e processamento da planta, buscando o aumento da produtividade dos canaviais. Dentre os fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência de fitodoenças, como por exemplo a escaldadura das folhas, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans. Essa doença causa a diminuição do valor energético do caldo extraído da planta, e a ausência de tratamento químico ou biológico acarreta na necessidade de reforma precoce dos canaviais, causando perdas significativas para o agronegócio brasileiro. Portanto, existe uma grande necessidade no desenvolvimento de novas moléculas capazes de atuar como defensivos agrícolas com eficiência e especificidade. Neste trabalho, duas estratégias foram empregadas para a identificação de moléculas como potenciais candidatos a agroquímicos. Na primeira, avaliou-se o potencial inibidor de moléculas de origem natural ou sintética em ensaios fenotípicos contra a cultura de X. albilineans, identificando dois derivados, um de nitrotiofeno e um de nitrofurano, capazes de inibir o crescimento bacteriano. Na segunda estratégia, duas enzimas da via de biossíntese de folatos, 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil di-hidropterina pirofosfoquinase (XaHPPK) e 7,8-di-hidroneopterina aldolase (XaDHNA), foram selecionadas como alvos moleculares. Métodos em biologia molecular e biologia estrutural foram empregados para a obtenção de proteínas puras e solúveis, visando-se a elucidação das estruturas tridimensionais e caracterização bioquímica dos alvos. Estudos de desnaturação térmica foram conduzidos para determinação da afinidade da XaHPPK pelo substrato natural 7,8-di-hidropterina (Kd = 97 ± 3 µM). Os experimentos de biologia estrutural resultaram na determinação da estrutura da XaHPPK a 2,3 Å de resolução (PDB ID, 5VSP) com o grupo espacial P212121. A obtenção da estrutura a alta resolução permitiu a aplicação de estratégias computacionais para a descoberta de potenciais inibidores. Os estudos da XaDHNA possibilitaram a coleta de um conjunto de dados à 3,5 Å de resolução, no grupo espacial I422. Os experimentos e resultados obtidos neste doutorado ampliam o conhecimento sobre a via de biossíntese de folatos em X. albilineans e abrem o caminho para a descoberta de novos inibidores antibacterianos utilizando técnicas baseadas na estrutura do alvo. / The importance of sugarcane as a source of renewable energy has pushed researchers to search for improvements in the process of cultivation and processing of the plant, looking after increase the productivity of sugarcane crops. Among known facts that limits sugarcane production, we highlight the occurrence of plant diseases, such as leaf scald, a bacterial disease caused by Xanthomonas albilineans. This disease decreases the energetic value of the broth extracted from the cane, and the absence of chemical or biological treatment entails the need for early refresh sugarcane plantations, causing significant losses for Brazilian agribusiness. Therefore, the economic interest in the development of new molecules capable of acting as agricultural defenses with efficiency and specificity is motivating. Acting on the essential biochemical pathways of the pathogen is a recurring strategy in the development of bioactive molecules. Thus, several inhibitor identification strategies were used. Firstly, the inhibitory potential of molecules from natural or synthetic origins were evaluated in phenotypic assays against the culture of X. albilineans, identifying two nitrothiophene and nitrofuran derivatives capable of inhibiting bacterial growth at 2 mM. In another strategy, the essential pathway of X. albilineans for folate biosynthesis was selected and two proteins of this pathway investigated: 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl dihydropteridine pyrophosphokinase (XaHPPK) and 7,8-dihydroneopterin aldolase (XaDHNA). Both molecular biology and structural biology methods were used to obtain pure and soluble proteins, aiming the obtaining of three-dimensional structures and biochemical characterization of targets. Studies with the XaHPPK protein for kinetic characterization made possible to calculate the Kd apparent (Kd = 97 ± 3 μM) for the substrate 7,8-dihydropterin. Structural biology experiments resulted in a 2.3 Å resolution structure in the space group P212121, available in the PDB under the 5VSP identifier. Structure based drug design for XaHPPK structure, SBDD, were performed using ZINC15 database with hierarchical filters and the Glide docking software. The XaDHNA studies enabled the collection of a set of data at 3.5 Å resolution in the space group I422. The experiments and results obtained in this doctorate increase the knowledge about the folate biosynthesis pathway in X. albilineans and open the way for the discovery of new antibacterial inhibitors using structure based drug design.
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Estudos estruturais e funcionais da enzima N5, N10 - metilenotetrahidrofolato-desidrogenase-ciclohidrolase de Xanthomonas albilineans aplicados à descoberta de candidatos a inibidores para o tratamento da escaldadura das folhas / Structural and functional studies of the enzyme N5, N10 -methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase of Xanthomonas albilineans applied to the discovery of inhibitor candidates for the treatment of leaf scaldBueno, Renata Vieira 05 April 2018 (has links)
A escaldadura das folhas, causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas albilineans, é uma das doenças mais importantes que afetam o cultivo da cana-de-açúcar, causando significativa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda da qualidade do caldo extraído. O impacto dessa doença somado à ausência de agentes químicos ou biológicos para o controle estimula a pesquisa para a descoberta e desenvolvimento de moléculas bioativas como candidatos a novos defensivos agrícolas. Nesse contexto, a enzima N5, N10-metilenotetrahidrofolato desidrogenase ciclohidrolase (FolD) destaca-se como potencial alvo molecular. O projeto de doutoramento visou a caracterização estrutural e funcional da FolD de X. albilineans (XaFolD), além da triagem de moléculas candidatas a inibidores. Para tanto, foram conduzidos estudos integrados em biologia molecular estrutural e química biológica. A expressão heteróloga e purificação da XaFolD resultaram na produção de proteína funcional e adequada aos ensaios de cristalização. A caracterização das atividades desidrogenase e ciclohidrolase da XaFolD indicou os valores de KM para os substratos de ambas as reações, N5, N10-metileno-tetrahidrofolato (50 ± 10 µM) e N5, N10-metenil-tetrahidrofolato (32 ± 3 µM) e do cofator NADP+ (688 ± 81 µM). A estrutura da XaFolD na forma apo, elucidada a 2,1 Å de resolução, revelou uma proteína constituída por 11 hélices alfa e 9 fitas beta distribuídas em um domínio N-terminal catalítico e um domínio C-terminal de ligação ao dinucleotídeo. A enzima pura foi utilizada para a triagem de 1.124 fragmentos por interferometria de biocamada (BLI) e foram identificados três ligantes, DDD00808259 (KD = 260 μM), DDD01305586 (KD = 3 mM) e DDD00100784 (KD = 210 μM), com valores de afinidade na faixa do submilimolar até baixo milimolar. Paralelamente, uma abordagem computacional foi empregada para a triagem virtual de base de dados de compostos como candidatos a ligantes da XaFolD. Os critérios utilizados resultaram na seleção e aquisição de 31 compostos de diferentes classes químicas para avaliação da atividade inibitória frente a enzima alvo. Por fim, ensaios fenotípicos de triagem de inibidores resultaram na descoberta de compostos capazes de inibir o crescimento in vitro de X. albilineans. Dentre os inibidores identificados o composto THP2 apresentou a maior potência, com valor determinado de EC50 igual a 23 ± 2 μM. Os dados estruturais, cinéticos e biofísicos obtidos nesta tese de doutoramento formam a base experimental e computacional para a descoberta e planejamento de inibidores candidatos a novos agroquímicos para o tratamento da escaldadura das folhas. / The leaf scald disease is a severe condition which affects sugarcane crops. Leaf scald is caused by the Gram-negative bacteria Xanthomonas albilineans and it has a dramatic impact on crop productivity, including the yield reduction and dropping the quality of the juice. The impact of this disease besides the absence of chemical or biological agents to treat it stimulates the research towards the discovery and development of bioactive molecules as lead candidates to new agrochemicals. In this context, the enzyme N5, N10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase (XaFolD) stands out as a potential molecular target. Facing this scenario, the PhD project comprised the structural and functional characterization of X. albilineans FolD (XaFolD) and the screening of molecules to identify inhibitors. For this purpose, integrated studies in structural molecular biology and biological chemistry have been carried out. Suitable protein for crystallization and kinetic assays was produced by heterologous expression. The XaFolD dehydrogenase and cyclohydrolase activities were characterized, revealing KM values of 50 ± 10 µM for N5, N10- methylenetetrahydrofolate, 32 ± 3 µM for N5, N10-methenyltetrahydrofolate, and 688 ± 81 µM for NADP+. The structure of XaFolD in the apo form was elucidated at 2.1 Å resolution and it revealed a protein consisting of 11 alpha helices and 9 beta sheets distributed in the catalytic N-terminal domain and the C-terminal dinucleotide binding domain. Screening of 1,124 fragments by biolayer interferometry (BLI) revealed three ligands, DDD00808259, DDD01305586 and DDD00100784, with determined KD values of 260 µM, 3 mM and 210 M, respectively. Furthermore, a virtual screening was performed to identify XaFolD ligands. As a result, 31 chemically diverse compounds were selected to be evaluated by potency assays. Additionally, phenotypical assays against X. albilineans have been performed and inhibitors were identified. Among them, the compound THP2 presented the highest potency, with a determined value of EC50 equal to 23 ± 2 µM. The structural, kinetic, and biophysical data obtained in this PhD thesis provide the molecular basis for discovering and planning bioactive molecules as agrochemicals to control leaf scald disease.
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Localisation in planta de Xanthomonas albilineans et identification de déterminants moléculaires impliqués dans la colonisation épiphyte de sa plante hôte, la canne à sucre / In planta localization of Xanthomonas albilineans and identification of molecular factors involved in epiphytic colonization of its host plant, the sugarcane.Mensi, Imène 18 November 2013 (has links)
Xanthomonas albilineans est l'agent causal de l'échaudure des feuilles, une des principales maladies bactériennes de la canne à sucre dont l'impact peut être très important lorsque des variétés sensibles sont infectées au champ. Les mécanismes qui régissent les interactions entre cet agent pathogène et la canne à sucre sont encore très peu connus. Les objectifs de ce travail étaient (i) d'identifier des déterminants moléculaires impliqués dans la survie épiphyte de X. albilineans et (ii) de préciser la localisation de la bactérie dans les tissus de la canne à sucre. Parmi les facteurs étudiés, les polysaccharides de surface et une protéine de la membrane externe (XaOmpA1) de X. albilineans s'avèrent indispensables pour la survie épiphyte de cet agent pathogène. En revanche, la molécule signal diffusible DSF et les métabolites secondaires codés par les gènes NRPS (« Non Ribosomal Peptide Synthetases ») ne sont pas requis pour l'installation de la bactérie en surface des feuilles, au moins en l'absence d'autres microorganismes compétiteurs. Toutefois, la colonisation optimale de la phyllosphère de la canne à sucre nécessite la présence d'un système DSF/RpfGC intact. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons vérifié la localisation in planta de X. albilineans par microscopie confocale, immunocytochimie, et microscopie électronique à transmission. Les observations microscopiques réalisées ont permis de montrer que X. albilineans n'est pas limitée au xylème de la canne à sucre, comme on le considérait jusqu'à présent. Bien au contraire, cette bactérie est capable de quitter le système vasculaire de sa plante hôte et de pénétrer dans d'autres types cellulaires, notamment les cellules du parenchyme non vasculaire. Il s'agit là, à notre connaissance, d'un nouveau mécanisme de colonisation d'une plante par une bactérie phytopathogène qui reste à décrypter. / Xanthomonas albilineans is the causal agent of leaf scald, a lethal disease of sugarcane that can significantly impact infected susceptible varieties in the field. The mechanisms that govern the interactions between this bacterial pathogen and its host plant are not well known. The objectives of this study were (i) to identify molecular factors involved in epiphytic survival of X. albilineans and (ii) to verify the localization of X. albilineans in sugarcane tissues. Among the studied factors, surface polysaccharides and an outer-membrane protein (XaOmpA1) of X. albilineans were crucial for epiphytic survival of this pathogen. Secondary metabolites synthesized by non-ribosomal peptide synthetases and the diffusible signal factor DSF were not critical for survival of X. albilineans on the sugarcane leaf surface, at least in absence of competing microorganisms. However, an intact DSF/RpfGC system was necessary for optimal colonization of the phyllosphere. In the second part of this study, we verified in planta localization of X. albilineans by confocal microscopy, immunochemistry and transmission electron microscopy. Microscopic observations allowed us to show that X. albilineans is not a xylem limited bacterium as it was believed until now. This pathogen is able to invade numerous cellular types including vascular and non-vascular parenchyma cells. To our knowledge, this is a novel invasion strategy of a plant pathogenic bacterium that has not previously been described, and that remains to be deciphered.
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Estudos estruturais e funcionais da enzima N5, N10 - metilenotetrahidrofolato-desidrogenase-ciclohidrolase de Xanthomonas albilineans aplicados à descoberta de candidatos a inibidores para o tratamento da escaldadura das folhas / Structural and functional studies of the enzyme N5, N10 -methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase of Xanthomonas albilineans applied to the discovery of inhibitor candidates for the treatment of leaf scaldRenata Vieira Bueno 05 April 2018 (has links)
A escaldadura das folhas, causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas albilineans, é uma das doenças mais importantes que afetam o cultivo da cana-de-açúcar, causando significativa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda da qualidade do caldo extraído. O impacto dessa doença somado à ausência de agentes químicos ou biológicos para o controle estimula a pesquisa para a descoberta e desenvolvimento de moléculas bioativas como candidatos a novos defensivos agrícolas. Nesse contexto, a enzima N5, N10-metilenotetrahidrofolato desidrogenase ciclohidrolase (FolD) destaca-se como potencial alvo molecular. O projeto de doutoramento visou a caracterização estrutural e funcional da FolD de X. albilineans (XaFolD), além da triagem de moléculas candidatas a inibidores. Para tanto, foram conduzidos estudos integrados em biologia molecular estrutural e química biológica. A expressão heteróloga e purificação da XaFolD resultaram na produção de proteína funcional e adequada aos ensaios de cristalização. A caracterização das atividades desidrogenase e ciclohidrolase da XaFolD indicou os valores de KM para os substratos de ambas as reações, N5, N10-metileno-tetrahidrofolato (50 ± 10 µM) e N5, N10-metenil-tetrahidrofolato (32 ± 3 µM) e do cofator NADP+ (688 ± 81 µM). A estrutura da XaFolD na forma apo, elucidada a 2,1 Å de resolução, revelou uma proteína constituída por 11 hélices alfa e 9 fitas beta distribuídas em um domínio N-terminal catalítico e um domínio C-terminal de ligação ao dinucleotídeo. A enzima pura foi utilizada para a triagem de 1.124 fragmentos por interferometria de biocamada (BLI) e foram identificados três ligantes, DDD00808259 (KD = 260 μM), DDD01305586 (KD = 3 mM) e DDD00100784 (KD = 210 μM), com valores de afinidade na faixa do submilimolar até baixo milimolar. Paralelamente, uma abordagem computacional foi empregada para a triagem virtual de base de dados de compostos como candidatos a ligantes da XaFolD. Os critérios utilizados resultaram na seleção e aquisição de 31 compostos de diferentes classes químicas para avaliação da atividade inibitória frente a enzima alvo. Por fim, ensaios fenotípicos de triagem de inibidores resultaram na descoberta de compostos capazes de inibir o crescimento in vitro de X. albilineans. Dentre os inibidores identificados o composto THP2 apresentou a maior potência, com valor determinado de EC50 igual a 23 ± 2 μM. Os dados estruturais, cinéticos e biofísicos obtidos nesta tese de doutoramento formam a base experimental e computacional para a descoberta e planejamento de inibidores candidatos a novos agroquímicos para o tratamento da escaldadura das folhas. / The leaf scald disease is a severe condition which affects sugarcane crops. Leaf scald is caused by the Gram-negative bacteria Xanthomonas albilineans and it has a dramatic impact on crop productivity, including the yield reduction and dropping the quality of the juice. The impact of this disease besides the absence of chemical or biological agents to treat it stimulates the research towards the discovery and development of bioactive molecules as lead candidates to new agrochemicals. In this context, the enzyme N5, N10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase-cyclohydrolase (XaFolD) stands out as a potential molecular target. Facing this scenario, the PhD project comprised the structural and functional characterization of X. albilineans FolD (XaFolD) and the screening of molecules to identify inhibitors. For this purpose, integrated studies in structural molecular biology and biological chemistry have been carried out. Suitable protein for crystallization and kinetic assays was produced by heterologous expression. The XaFolD dehydrogenase and cyclohydrolase activities were characterized, revealing KM values of 50 ± 10 µM for N5, N10- methylenetetrahydrofolate, 32 ± 3 µM for N5, N10-methenyltetrahydrofolate, and 688 ± 81 µM for NADP+. The structure of XaFolD in the apo form was elucidated at 2.1 Å resolution and it revealed a protein consisting of 11 alpha helices and 9 beta sheets distributed in the catalytic N-terminal domain and the C-terminal dinucleotide binding domain. Screening of 1,124 fragments by biolayer interferometry (BLI) revealed three ligands, DDD00808259, DDD01305586 and DDD00100784, with determined KD values of 260 µM, 3 mM and 210 M, respectively. Furthermore, a virtual screening was performed to identify XaFolD ligands. As a result, 31 chemically diverse compounds were selected to be evaluated by potency assays. Additionally, phenotypical assays against X. albilineans have been performed and inhibitors were identified. Among them, the compound THP2 presented the highest potency, with a determined value of EC50 equal to 23 ± 2 µM. The structural, kinetic, and biophysical data obtained in this PhD thesis provide the molecular basis for discovering and planning bioactive molecules as agrochemicals to control leaf scald disease.
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Estudos estruturais de enzimas da via de biossíntese de folatos de Xanthomonas albilineans para o desenvolvimento de novos candidatos a agroquímicos para a cultura de cana-de-açúcar / Structural studies of folate biosynthesis pathway enzymes from Xanthomonas albilineans for the development of new agrochemical candidates for sugarcane cropGustavo Machado Alvares de Lima 22 September 2017 (has links)
O destaque da cana-de-açúcar como fonte de energia renovável tem motivado a busca por melhorias no processo de cultivo e processamento da planta, buscando o aumento da produtividade dos canaviais. Dentre os fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência de fitodoenças, como por exemplo a escaldadura das folhas, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans. Essa doença causa a diminuição do valor energético do caldo extraído da planta, e a ausência de tratamento químico ou biológico acarreta na necessidade de reforma precoce dos canaviais, causando perdas significativas para o agronegócio brasileiro. Portanto, existe uma grande necessidade no desenvolvimento de novas moléculas capazes de atuar como defensivos agrícolas com eficiência e especificidade. Neste trabalho, duas estratégias foram empregadas para a identificação de moléculas como potenciais candidatos a agroquímicos. Na primeira, avaliou-se o potencial inibidor de moléculas de origem natural ou sintética em ensaios fenotípicos contra a cultura de X. albilineans, identificando dois derivados, um de nitrotiofeno e um de nitrofurano, capazes de inibir o crescimento bacteriano. Na segunda estratégia, duas enzimas da via de biossíntese de folatos, 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil di-hidropterina pirofosfoquinase (XaHPPK) e 7,8-di-hidroneopterina aldolase (XaDHNA), foram selecionadas como alvos moleculares. Métodos em biologia molecular e biologia estrutural foram empregados para a obtenção de proteínas puras e solúveis, visando-se a elucidação das estruturas tridimensionais e caracterização bioquímica dos alvos. Estudos de desnaturação térmica foram conduzidos para determinação da afinidade da XaHPPK pelo substrato natural 7,8-di-hidropterina (Kd = 97 ± 3 µM). Os experimentos de biologia estrutural resultaram na determinação da estrutura da XaHPPK a 2,3 Å de resolução (PDB ID, 5VSP) com o grupo espacial P212121. A obtenção da estrutura a alta resolução permitiu a aplicação de estratégias computacionais para a descoberta de potenciais inibidores. Os estudos da XaDHNA possibilitaram a coleta de um conjunto de dados à 3,5 Å de resolução, no grupo espacial I422. Os experimentos e resultados obtidos neste doutorado ampliam o conhecimento sobre a via de biossíntese de folatos em X. albilineans e abrem o caminho para a descoberta de novos inibidores antibacterianos utilizando técnicas baseadas na estrutura do alvo. / The importance of sugarcane as a source of renewable energy has pushed researchers to search for improvements in the process of cultivation and processing of the plant, looking after increase the productivity of sugarcane crops. Among known facts that limits sugarcane production, we highlight the occurrence of plant diseases, such as leaf scald, a bacterial disease caused by Xanthomonas albilineans. This disease decreases the energetic value of the broth extracted from the cane, and the absence of chemical or biological treatment entails the need for early refresh sugarcane plantations, causing significant losses for Brazilian agribusiness. Therefore, the economic interest in the development of new molecules capable of acting as agricultural defenses with efficiency and specificity is motivating. Acting on the essential biochemical pathways of the pathogen is a recurring strategy in the development of bioactive molecules. Thus, several inhibitor identification strategies were used. Firstly, the inhibitory potential of molecules from natural or synthetic origins were evaluated in phenotypic assays against the culture of X. albilineans, identifying two nitrothiophene and nitrofuran derivatives capable of inhibiting bacterial growth at 2 mM. In another strategy, the essential pathway of X. albilineans for folate biosynthesis was selected and two proteins of this pathway investigated: 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl dihydropteridine pyrophosphokinase (XaHPPK) and 7,8-dihydroneopterin aldolase (XaDHNA). Both molecular biology and structural biology methods were used to obtain pure and soluble proteins, aiming the obtaining of three-dimensional structures and biochemical characterization of targets. Studies with the XaHPPK protein for kinetic characterization made possible to calculate the Kd apparent (Kd = 97 ± 3 μM) for the substrate 7,8-dihydropterin. Structural biology experiments resulted in a 2.3 Å resolution structure in the space group P212121, available in the PDB under the 5VSP identifier. Structure based drug design for XaHPPK structure, SBDD, were performed using ZINC15 database with hierarchical filters and the Glide docking software. The XaDHNA studies enabled the collection of a set of data at 3.5 Å resolution in the space group I422. The experiments and results obtained in this doctorate increase the knowledge about the folate biosynthesis pathway in X. albilineans and open the way for the discovery of new antibacterial inhibitors using structure based drug design.
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Molecular characterisation and detection of xanthomonas albilineans, the sugarcane leaf scald pathogen.Permaul, Kugenthiren. January 1994 (has links)
No abstract available. / Thesis (M.Sc.)-University of Durban Westville, 1994.
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Rôle du système de sécrétion de type III SPI-1 et des mégaenzymes NRPS dans le cycle de vie de Xanthomonas albilineans, lagent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre / Role of the SPI-1 type III secretion system and of the NRPS megaenzymes in the life cycle of Xanthomonas albilineans, the causal agent of sugarcane leaf scaldMarguerettaz, Mélanie 07 December 2010 (has links)
Xanthomonas albilineans est l'agent causal de l'échaudure des feuilles de la canne à sucre. Peu d'éléments sont connus sur les bases moléculaires de l'invasion du xylème de la canne à sucre par cette bactérie. Nous manquons également d'informations sur l'écologie de X. albilineans qui, dans certaines zones de culture et dans des conditions climatiques particulières, est capable d'infecter la canne à sucre par voie aérienne. La découverte récente dans le génome de X. albilineans de clusters de gènes spécifiques à cette espèce ouvre de nouvelles perspectives. Bien qu'aucune association de X. albilineans avec un hôte animal n'ait été décrite à ce jour, cette bactérie possède un système de sécrétion de type III SPI-1 (Salmonella Pathogenicity Island-1). Nous avons montré que ce système n'est pas indispensable à la multiplication de X. albilineans in planta. Des analyses de phylogénie, de recombinaison et de sélection de ce système au sein de souches représentatives de la diversité de X. albilineans permettent de proposer de nouvelles hypothèses sur l'écologie de cette bactérie. X. albilineans possède aussi plusieurs clusters de gènes NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase), dont l'un est impliqué dans la biosynthèse de l'albicidine, une phytotoxine responsable de l'apparition de symptômes foliaires. Des analyses in silico ont permis de montrer que les autres clusters de gènes NRPS de X. albilineans sont impliqués dans la biosynthèse et la sécrétion de nouvelles petites molécules. Le rôle de ces molécules reste inconnu mais, d'après l'analyse fonctionnelle des NRPS de X. albilineans, au moins une de ces molécules influence la multiplication de la bactérie in planta. / Xanthomonas albilineans is a systemic, xylem-invading pathogen that causes leaf scald disease of sugarcane. Very little is currently known about the molecular bases of the invasion of the sugarcane xylem by this bacterium. Information is also lacking on the ecology of X. albilineans which is able, in certain geographical locations and under certain climate conditions, to infect sugarcane after aerial transmission. The recent discovery in the genome of X. albilineans of gene clusters specific to this species offers new research perspectives. X. albilineans, which is not known to be animal-associated, possesses a type III secretion system (T3SS) belonging to the SPI-1 (Salmonella Pathogenicity Island-1) injectisome family. Functional analyses confirmed that this system is not required by X. albilineans to spread within xylem vessels and to cause disease symptoms. Based on phylogenetic, recombination and selection analyses of T3SS SPI-1 sequences from strains spanning the genetic diversity of X. albilineans, new hypotheses were proposed regarding the ecology of this bacterium. X. albilineans possesses also several NRPS (NonRibosomal Peptide Synthetase) gene clusters, including a gene cluster which was previously shown to be involved in the biosynthesis of albicidin, a phytotoxin causing foliar symptoms. In silico analyses indicated that other NRPS gene clusters of X. albilineans are involved in biosynthesis and secretion of new small molecules with unknown function. However, functional analyses of NRPSs showed that at least one these new small molecules influence the spreading of X. albilineans in planta.
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Estudos estruturais e moleculares da enzima fosfopanteteinil transferase de Xanthomonas albilineans: alvo molecular para o desenvolvimento de novos agroquímicos para cultura de cana-de-açúcar / Structural and molecular studies of xanthomonas albilineans phosphopantetheinyl transferase enzyme: molecular target for new agrochemicals development for sugarcane culturesLima, Gustavo Machado Alvares de 23 July 2013 (has links)
A cana-de-açúcar é uma das principais fontes de energia renovável, constituindo a matéria-prima mais importante na busca por energia limpa e sustentável. Os benefícios ambientais provenientes da produção e do uso dos derivados de cana-de-açúcar fomentam o desenvolvimento de métodos e produtos que aumentem, de modo sustentável, a geração de bioenergia. Dentre os diversos fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência e a severidade de fitopatologias como a escaldadura das folhas. Essa doença, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans, causa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda de qualidade do caldo extraído que determinam prejuízos econômicos significativos para os agricultores. Atualmente, não há alternativas disponíveis para o controle químico ou biológico dessa fitopatologia. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas moléculas como defensivos agrícolas que sejam eficazes, seletivas, de baixo custo e impacto ao meio ambiente. A X. albilineans produz uma família de antibióticos e fitotoxinas conhecida como albicidinas. As enzimas envolvidas na biossíntese de albicidinas são alvos moleculares extremamente atrativos para o planejamento de novos agroquímicos. Entre as enzimas dessa via, destaca-se a fosfopanteteinil transferase (XaPPT, E.C. 2.7.8.7), uma enzima essencial para o desenvolvimento da X. albilineans. Essa dissertação está dividida em duas partes: i. estudos computacionais e ii. estudos experimentais. Na parte computacional foi desenvolvida uma nova ferramenta, denominada ViTaMIn para auxiliar o desenvolvimento de modelos tridimensionais (3D) de proteínas. A enzima XaPPT foi utilizada como estudo de caso para validar o programa. Os resultados obtidos indicaram que ViTaMIn foi capaz de auxiliar a construção de um modelo 3D robusto da XaPPT. Além disso, foi verificado que ViTaMIn é uma alternativa útil para usuários iniciante e experientes na modelagem molecular. O modelo de XaPPT construído foi utilizado na triagem virtual para a identificação de novos candidatos a inibidores. A estratégia incluiu a aplicação de filtros moleculares e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 10 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Na parte experimental, o cultivo de culturas de X. albilineans foi padronizado e estudos de biologia molecular com a XaPPT conduzidos a partir da extração de DNA genômico da bactéria. Estratégias clássicas e modernas foram empregadas para a clonagem da XaPPT. Os resultados obtidos indicaram a obtenção de proteína expressa na forma solúvel. Os trabalhos integrando estudos computacionais e experimentais apresentados nessa dissertação de mestrado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o desenvolvimento de novos candidatos a agroquímicos para a cultura de cana de açúcar. / Sugarcane is a major source of renewable energy, representing the most important source for clean and sustainable energy. The environmental benefits collected from the production and use of sugarcane derivatives boost the development of new methods and products to improve, in a sustainable way, bioenergy generation. However, the occurrence and severity of plant diseases, such as leaf scald, hinder the productivity of sugarcane crops. Sugarcane leaf scald is a widespread and devastating disease caused by the bacteria Xanthomonas albilineans. The disease has a dramatic impact on crop productivity, including reduced yields and drop in quality of the juice. Currently, there is no chemical or biological treatment for disease control. Therefore, there is an urgent need for new effective and selective pesticides with low cost and environmental impact. The X. albilineans produces a family of antibiotics and phytotoxins known as albicidin. The enzymes involved in the biosynthesis of albicidin are attractive targets for the design of new agrochemicals. Among them, the phosphopantetheinyl transferase (XaPPT, EC 2.7.8.7) enzyme plays an essential role to the development of X. albilineans. This dissertation is divided into two parts: i. computational studies and ii. experimental studies. In the computational part, we developed a new tool, named ViTaMIn to assist the development of three-dimensional models (3D) of proteins. The XaPPT enzyme was employed as a case study to validate the program. The results indicated that ViTaMIn was capable of assisting the construction of a robust 3D model of XaPPT. Moreover, Vitamin is a useful alternative for beginners and advanced modelers. The XaPPT model was used in virtual screening approach to identify new candidate inhibitors. The strategy included the application of molecular filters and molecular docking studies which afforded 10 inhibitor candidates for the target enzyme. In the experimental part, X. albilineans was cultured and standardized. On the basis of that, molecular biology studies were conducted on XaPPT. Classical and modern strategies were employed to cloning XaPPT. The results indicated that protein is expressed soluble. The integration of computational and experimental studies presented in this dissertation are important contributions in the development of strong scientific basis for the design of new agrochemicals for sugarcane cultures.
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Estudos estruturais e moleculares da enzima fosfopanteteinil transferase de Xanthomonas albilineans: alvo molecular para o desenvolvimento de novos agroquímicos para cultura de cana-de-açúcar / Structural and molecular studies of xanthomonas albilineans phosphopantetheinyl transferase enzyme: molecular target for new agrochemicals development for sugarcane culturesGustavo Machado Alvares de Lima 23 July 2013 (has links)
A cana-de-açúcar é uma das principais fontes de energia renovável, constituindo a matéria-prima mais importante na busca por energia limpa e sustentável. Os benefícios ambientais provenientes da produção e do uso dos derivados de cana-de-açúcar fomentam o desenvolvimento de métodos e produtos que aumentem, de modo sustentável, a geração de bioenergia. Dentre os diversos fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência e a severidade de fitopatologias como a escaldadura das folhas. Essa doença, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans, causa diminuição da produtividade, necessidade de reforma precoce dos canaviais e queda de qualidade do caldo extraído que determinam prejuízos econômicos significativos para os agricultores. Atualmente, não há alternativas disponíveis para o controle químico ou biológico dessa fitopatologia. Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas moléculas como defensivos agrícolas que sejam eficazes, seletivas, de baixo custo e impacto ao meio ambiente. A X. albilineans produz uma família de antibióticos e fitotoxinas conhecida como albicidinas. As enzimas envolvidas na biossíntese de albicidinas são alvos moleculares extremamente atrativos para o planejamento de novos agroquímicos. Entre as enzimas dessa via, destaca-se a fosfopanteteinil transferase (XaPPT, E.C. 2.7.8.7), uma enzima essencial para o desenvolvimento da X. albilineans. Essa dissertação está dividida em duas partes: i. estudos computacionais e ii. estudos experimentais. Na parte computacional foi desenvolvida uma nova ferramenta, denominada ViTaMIn para auxiliar o desenvolvimento de modelos tridimensionais (3D) de proteínas. A enzima XaPPT foi utilizada como estudo de caso para validar o programa. Os resultados obtidos indicaram que ViTaMIn foi capaz de auxiliar a construção de um modelo 3D robusto da XaPPT. Além disso, foi verificado que ViTaMIn é uma alternativa útil para usuários iniciante e experientes na modelagem molecular. O modelo de XaPPT construído foi utilizado na triagem virtual para a identificação de novos candidatos a inibidores. A estratégia incluiu a aplicação de filtros moleculares e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 10 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Na parte experimental, o cultivo de culturas de X. albilineans foi padronizado e estudos de biologia molecular com a XaPPT conduzidos a partir da extração de DNA genômico da bactéria. Estratégias clássicas e modernas foram empregadas para a clonagem da XaPPT. Os resultados obtidos indicaram a obtenção de proteína expressa na forma solúvel. Os trabalhos integrando estudos computacionais e experimentais apresentados nessa dissertação de mestrado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o desenvolvimento de novos candidatos a agroquímicos para a cultura de cana de açúcar. / Sugarcane is a major source of renewable energy, representing the most important source for clean and sustainable energy. The environmental benefits collected from the production and use of sugarcane derivatives boost the development of new methods and products to improve, in a sustainable way, bioenergy generation. However, the occurrence and severity of plant diseases, such as leaf scald, hinder the productivity of sugarcane crops. Sugarcane leaf scald is a widespread and devastating disease caused by the bacteria Xanthomonas albilineans. The disease has a dramatic impact on crop productivity, including reduced yields and drop in quality of the juice. Currently, there is no chemical or biological treatment for disease control. Therefore, there is an urgent need for new effective and selective pesticides with low cost and environmental impact. The X. albilineans produces a family of antibiotics and phytotoxins known as albicidin. The enzymes involved in the biosynthesis of albicidin are attractive targets for the design of new agrochemicals. Among them, the phosphopantetheinyl transferase (XaPPT, EC 2.7.8.7) enzyme plays an essential role to the development of X. albilineans. This dissertation is divided into two parts: i. computational studies and ii. experimental studies. In the computational part, we developed a new tool, named ViTaMIn to assist the development of three-dimensional models (3D) of proteins. The XaPPT enzyme was employed as a case study to validate the program. The results indicated that ViTaMIn was capable of assisting the construction of a robust 3D model of XaPPT. Moreover, Vitamin is a useful alternative for beginners and advanced modelers. The XaPPT model was used in virtual screening approach to identify new candidate inhibitors. The strategy included the application of molecular filters and molecular docking studies which afforded 10 inhibitor candidates for the target enzyme. In the experimental part, X. albilineans was cultured and standardized. On the basis of that, molecular biology studies were conducted on XaPPT. Classical and modern strategies were employed to cloning XaPPT. The results indicated that protein is expressed soluble. The integration of computational and experimental studies presented in this dissertation are important contributions in the development of strong scientific basis for the design of new agrochemicals for sugarcane cultures.
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Otimização da detecção de raquitismo da soqueira e escaldadura das folhas em cana-de-açúcar utilizando PCR / Optimization of detection of Ratoon Stunting Disease and Leaf Scald Disease in sugarcane by PCRDIAS, Vanessa Duarte 02 March 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012-03-02 / The sugarcane production areas are increasing in Brazil due to increased ethanol consumption by flex fuel cars. The planted area is growing, but productivity has been declining in recent years, and factors such as incidence of diseases in the crop may be contributing to this situation. Among the diseases, bacteria such as scald of the leaves and ratoon stunting disease, are of great importance to the crop because they can reduce productivity by up to 30% and the symptoms are not always displayed in the field, thus requiring advanced techniques to detect such bacterial diseases. Among the most used techniques for diagnosis serological tests are quite common, which has as main advantage the capacity of quantitative detection of the presence of bacteria in the culms. However, this detection is only possible if the bacterial title is relatively high. The PCR technique method is more sensitive for detecting low levels of bacteria in stems, but the DNA extractions should be performed in order to purify the DNA to reduce the presence of inhibitory substances in the extract. Thus in this study five different methods of DNA extraction of Xanthomonas albilineans and Leifsonia xyli subsp. xyli were tested and performed in three steps: pure bacteria, bacteria inoculated directly in the extract from five different varieties of sugarcane, and extract from a stem knowingly infected with these bacteria. The results indicate that the amplifications occur more frequently when the products and repeatability of the extractions are diluted by 10-4 in the Leaf Scald. Without this diluition steps, the amplification does not occur, even with the method of DNA extraction considered as a standard. Thus, it is concluded that the detection does not happen if the DNA extraction product is not diluted at least 1000 times, which should prevent the action of inhibitory factors that can hinder the PCR reactions. As for the ratoon stunting disease additional studies are needed to enable its detection by PCR. / O cultivo de cana-de-açúcar está em expansão no Brasil, devido ao crescente consumo de etanol por carros bicombustíveis. A área plantada está em crescimento, mas a produtividade nos últimos anos vem decrescendo, e fatores como incidência de doenças podem estar contribuindo para tal situação. Dentre as doenças, as bacterianas, como o Raquitismo das Soqueiras e a Escaldadura das Folhas, possuem grande importância para a cultura, pois podem reduzir a produtividade em até 30% e nem sempre os sintomas são visualizados em campo, necessitando assim de técnicas avançadas de detecção. Dentre as técnicas para diagnose, a mais utilizada por laboratórios são os testes sorológicos, que tem como vantagem detectar quantitativamente a presença das bactérias nos colmos mas, no entanto, possui a desvantagem de detectar somente quando a população bacteriana está relativamente alta. A técnica de PCR é mais sensível, detectando níveis baixos da população dessa bactéria nos colmos, e as etapas de extrações de DNA devem purificar o DNA para a redução da presença de substâncias inibidoras presentes no extrato. Assim, neste trabalho foram testadas cinco diferentes metodologias de extração de DNA para Xanthomonas albilineans e Leifsonia xyli subsp. xyli realizadas em três fontes: bactérias puras, bactérias adicionadas diretamente no caldo de cinco diferentes variedades de cana-de-açúcar, e caldo de colmos infectados com as bacterioses. Os resultados demonstram que as amplificações acontecem com maior freqüência e repetibilidade quando os produtos das extrações são diluídos em uma proporção de 10-4 para Escaldadura das folhas. Sem diluições as amplificações não ocorrem, mesmo com o método de extração de DNA com elevado grau de pureza, tal como CTAB. Assim, conclui-se que a detecção não ocorre se o produto das extrações de DNA não for diluído ao menos 1000 vezes, provavelmente reduzindo-se desta forma, o nível de inibidores presentes, proporcionando resultados positivos na técnica de amplificação via PCR. Para Raquitismo das soqueiras não conseguimos detectar Leifonia xyli subsp. xyli através de métodos rápidos de extração de DNA.
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