Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-11T18:56:25Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 956880 bytes, checksum: 9c1c12f9f76e60035b27129c264ec216 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T18:56:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 956880 bytes, checksum: 9c1c12f9f76e60035b27129c264ec216 (MD5) Previous issue date: 2017-08-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A pústula-bacteriana em soja é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. glycines. Esta doença teve aumento expressivo em sua agressividade nos cultivares de soja nas últimas safras. O principal método de controle da pústula-bacteriana é o uso de cultivares resistentes. A identificação de fontes de resistência à pústula-bacteriana é um desafio para os melhoristas, uma vez que existem várias estirpes da fitobactéria e interação genótipos x estirpes para a resistência ao patógeno. O que pode ser resolvido com o auxílio de marcadores moleculares SNPs via análise de associação genômica ampla. Diante disso, objetivou-se caracterizar fenotipicamente 118 genótipos de soja quanto à resistência a X. axonopodis pv. glycines; identificar marcadores moleculares do tipo SNPs ligados a genes responsáveis pela resistência à pústula-bacteriana e identificar cultivares de soja portadores de alelos de resistência à pústula bacteriana. Foram inoculados 118 genótipos de soja com os isolados XAG2440 p e XAG2447. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizados, com sete repetições. A parcela experimental foi um pote plástico de 200 ml de volume com uma planta. A severidade da doença foi avaliada 15 dias após a inoculação com uma escala de notas de severidade de pústula bacteriana de 1 a 5, em que 1= a ausência de pústulas e 5= maior severidade de pústula bacteriana. O agrupamento das médias de severidade da doença dos genótipos pelo teste de Skott-Knott permitiu a formação de cinco grupos de genótipos quando se usou a estirpe XAG2440 p e três grupos com a estirpe XAG2447.O genótipo CD244RR foi resistente a ambas as estirpes. Já o genótipo TMG 7161RR foi o primeiro a apresentar sintomas de pústula bacteriana, mostrando-se altamente suscetível à ação de ambas as estirpes. Foram identificados onze potenciais marcadores SNPs em cinco cromossomos associados com a resistência à pústula-bacteriana causada pela estirpe XAG2440 p . O marcador Gm03_46214163_C_T é o mais fortemente associado com a resistência à pústula-bacteriana causada pela estirpe XAG2440 p e está localizado no cromossomo 3. Para a estirpe XAG2447 foram identificados cinco potenciais marcadores SNPs em três cromossomos. O marcador Gm17_7280661_C_T localizado no cromossomo 17 é o marcador mais fortemente associado à resistência à pústula- bacteriana causada pela estirpe XAG2447. Com base nos marcadores recomendamos fvcruzamentos envolvendo as cultivares CD244RR, CD243RR, CD5969, FUNDACEP55RR e FUNDACEP58RR para obter genótipos portadores de todos os alelos de resistência à estirpe XAG2440 p . Esses marcadores, depois de validados, poderão ser utilizados para seleção assistida por marcadores, de forma a aumentar a frequência de alelos de resistência à ação das estirpes XAG2440 p e XAG2447. / Bacterial pustule in soybean is caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. glycines. This disease had an expressive increase in its aggressiveness in soybean cultivars in the last harvests. The main method control of bacterial pustule is the use of resistant cultivars. The identification of sources of resistance to bacterial pustule is a challenge for breeders as there are several strains of this phytobacteria and interaction genotypes x strains for resistance to the pathogen. What can be solved with the identification of molecular markers SNPs with Genome-wide association studies. On this, the objective of this study was to characterize phenotypically 118 soybean genotypes for resistance to X. axonopodis pv. glycines; to identify molecular markers of the SNPs type linked to genes responsible for resistance to bacterial pustule and to identify soybean cultivars carrying resistance alleles to bacterial pustule. 118 soybean genotypes were inoculated with the isolates XAG2440p and XAG2447. The experimental design was the completely randomized with seven replications. The experimental plot was a plastic pot of 200 ml volume with a plant per pot. After 15 days of inoculation plants were examined for lesions characteristic of bacterial pustule with a scale of bacterial pustule severity scores from 1 to 5, where 1 = absence of pustules and 5 = greater severity of bacterial pustule. The clustering of disease severity averages of the genotypes by the Skott-Knott test allowed the formation of five genotype groups when using the strain XAG2440p and three groups with the strain XAG2447. The genotype CD244RR was resistant to both strains. The genotype TMG 7161RR was the first to present symptoms of bacterial pustule, being highly susceptible to the action of both strains. Eleven potential SNPs markers were identified on five chromosomes associated with resistance to bacterial pustule caused by strain XAG2440p. The marker Gm03_46214163_C_T is most strongly associated with resistance to bacterial pustule caused by strain XAG2440p and is located on chromosome 3. For the strain XAG2447 were identified five potential SNPs markers on three chromosomes. The marker Gm17_7280661_C_T located on chromosome 17 is the marker most strongly associated with resistance to bacterial pustule caused by strain XAG2447. Based on the markers we recommend crosses involving the cultivars CD244RR, CD243RR, CD5969, FUNDACEP55RR and FUNDACEP58RR to obtain genotypes carrying all the strain resistance alleles XAG2440p. These markers, once validated, may be used for marker- assisted selection in order to increase the frequency of resistance alleles to strains XAG2440p and XAG2447.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:30:00Z No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:30:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T17:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can increase agricultural productivity by promoting growth through production of plant hormones, facilitating the uptake of nutrients and chemicals on the soil, as well as inhibiting plant stress factors. Streptomyces spp. (Stm) are bacteria with great biotechnological potential, because in addition to its growth promotion and plant defense induction, they are also known as great producers of secondary metabolites, including antibiotics and phenazines. Soybean [Glycine max (L) Merrill] is one of the main legume crop grown around the world and Brazil is the second largest producer. Its production is affected by many diseases, among which bacterial pustule caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). The objective of this project was to evaluate isolates of Streptomyces spp. obtained from the rhizosphere of Fabaceae plants regarding characteristics of PGPR, as well as the modulation capacity of soybean defenses in response to the phytopathogen Xag. Eleven isolates of Streptomyces spp. were screened for PGPR traits by siderophores production, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, indole-3-acetic acid (IAA) and phenazines. For a taxonomic identification and growth evaluation of soybean plants, three isolates were selected for their biochemical characteristics. The growth promoting assay was performed in greenhouse using bacterized seeds with the selected isolate and sterile distilled water was use for the control. Length, fresh and dry weight from shoot and root at 15, 30 and 45 days of cultivation were the evaluated parameters. For evaluation of the induction capacity of defense mechanisms of soybean plants, the isolate that obtained the best performance in the growth promotion test was selected. Seeds of soybeans, from sensitive cultivars and resistant to Xag, were bacterized with the selected Stm isolate and grown under greenhouse conditions. The plants were challenged with Xag 15 days after emergence. The treatments consisted of (a) plants treated with sterile distilled water (absolute control); (b) plants bacterized with Stm CLV45 (Stm45); (c) water-treated and Xag challenged plants; and (d) plants bacterized with StmCLV45 and challenged with Xag (Stm45+Xag). The enzymatic responses related to the defense pathways were evaluated biochemically, by analyzing the activity of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and by the production of phenolic compounds at times 0, 24, 48, 72 and 144 hours post infection (hpi) of Xag. The expression of the genes related to the defense in Xag challenged soybean plants was determined by the relative expression of the genes PAL, JAZ, ERF5 and PR1 by qPCR at times 0, 12, 24 and 48 hpi. The results of the biochemical analysis indicated the isolates CLV42, CLV44 and CLV46 as the major producers of siderophores and CLV41, CLV45 and CLV46 isolates with higher ACC deaminase activity. All isolates were able to produce IAA, highlighting the isolate CLV45, which produced 398.53 ?g AIA g-1 cell. Phenazine pyocyanin (PYO) was also detected in all isolates, but the same did not occur for the 1-carboxylic acid phenazine (PCA), only produced by CLV41, CLV43 and CLV45. The isolates CLV42, CLV44 and CLV45 were selected for their PGPR characteristics for the growth promotion trial of greenhouse soybean plants and taxonomically characterized as species of the genus Streptomyces. None of the isolates evaluated in the trial caused a growth deficit in soybean plants. The CLV45 isolate significantly promoted the growth of soybean shoots in 36.63%, corroborated by the highest dry mass, 17.97%, in relation to the control group, being selected for soybean defense pathways induction. Expression of PAL gene was moderately enhanced in susceptible Stm45+Xag plants at 12 hpi, followed by increase of PAL enzyme activity from 48 to 144 hpi, although corresponding accumulation of phenolic compounds was not recorded. In the resistant cultivar, the highlighted expression of PAL in Stm45+Xag plants resulted in high activity of this enzyme. Enhanced expression of ERF5 and decrease on JAZ gene at 12 hpi in Stm45+Xag plants from both cultivars suggested that ET and JA play a concert role on induced systemic defense by Streptomyces sp. CLV45 against Xag in soybean. / As rizobact?rias promotoras de crescimento de plantas (PGPR) podem aumentar a produtividade agr?cola, atuando atrav?s da promo??o de crescimento vegetal por meio de fitorm?nios reguladores de crescimento, facilitando a capta??o de nutrientes e de compostos qu?micos no solo, bem como inibindo fatores de estresse vegetal. Bact?rias do g?nero Streptomyces spp. (Stm) apresentam grande potencial biotecnol?gico, pois al?m de promoverem o crescimento e a indu??o de defesa vegetal, tamb?m s?o conhecidas pela grande produ??o de metab?litos secund?rios, incluindo antibi?ticos e fenazinas. A soja [Glycine max (L.) Merrill] ? uma das principais leguminosas cultivadas no mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor. Sua produ??o ? afetada por in?meras doen?as, como a P?stula bacteriana causada pelo fitopat?geno Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). O objetivo deste trabalho foi avaliar 11 isolados de Streptomyces spp. oriundos da rizosfera de plantas de Fabaceae quanto ?s caracter?sticas de PGPR, bem como, ? capacidade de modula??o das vias de defesa de plantas de soja em resposta ? fitobact?ria patog?nica Xag. Os isolados foram avaliados quanto ?s caracter?sticas de PGPR pela produ??o de sider?foros, de ?cido indolac?tico (AIA), da enzima 1-aminociclopropano-1-?cido carbox?lico (ACC) desaminase e de fenazinas. Para a identifica??o taxon?mica e a avalia??o da promo??o de crescimento de plantas de soja foram selecionados tr?s isolados com caracter?sticas de PGPR. O ensaio de promo??o de crescimento ocorreu em casa de vegeta??o por meio da microbioliza??o das sementes pelos isolados selecionados e o controle com ?gua destilada est?ril. Os par?metros avaliados foram: comprimento, massa fresca e seca, de parte a?rea e raiz, aos 15, 30 e 45 dias de cultivo. Para a avalia??o da capacidade de indu??o dos mecanismos de defesa de plantas de soja, foi selecionado o isolado que obteve o melhor desempenho no ensaio de promo??o de crescimento. Sementes de soja, de cultivar sens?vel e resistente ? Xag, foram microbiolizadas com o isolado de Stm selecionado e cultivadas em casa de vegeta??o. As plantas obtidas foram desafiadas com Xag, 15 dias ap?s a sua emerg?ncia. Os tratamentos consistiram de (a) sementes tratadas com ?gua destilada est?ril (controle absoluto); (b) sementes microbiolizadas com StmCLV45 (Stm45); (c) sementes tratadas com ?gua destilada est?ril e plantas desafiadas com Xag (Xag); e (d) sementes microbiolizadas StmCLV45 e plantas desafiadas com Xag (Stm45+Xag). As respostas enzim?ticas relacionadas ?s vias de defesa foram avaliadas bioquimicamente, pela an?lise da atividade da fenilalanina am?nia liase (PAL) e pela produ??o dos compostos fen?licos, nos tempos 0, 24, 48, 72 e 144 horas p?s inocula??o (hpi) da Xag. A express?o dos genes relacionados ? defesa das plantas de soja desafiadas com Xag foi determinada pela express?o relativa de JAZ, ERF5, PAL e PR1 por qPCR, nos tempos 0, 12, 24 e 48 hpi. Os resultados da an?lise bioqu?mica indicaram os isolados CLV42, CLV44 e CLV46 como maiores produtores de sider?foros e os isolados CLV41, CLV45 e CLV46 com maior atividade de ACC desaminase. Todos os isolados foram capazes de produzir AIA, com destaque para o isolado CLV45, que produziu 398,53 ?g AIA g-1 de c?lulas. A fenazina piocianina (PYO) tamb?m foi detectada em todos os isolados, entretanto o mesmo n?o ocorreu para a fenazina 1-?cido carbox?lico (PCA), somente produzida por CLV41, CLV43 e CLV45. Os isolados CLV42, CLV44 e CLV45 foram selecionados por suas caracter?sticas de PGPR para o ensaio de promo??o do crescimento de plantas de soja em casa de vegeta??o e caracterizados taxonomicamente como esp?cies do g?nero Streptomyces. Nenhum dos isolados avaliados no ensaio causou d?ficit de crescimento em plantas de soja. O isolado CLV45 promoveu significativamente o crescimento de parte a?rea de plantas soja, em 36,63%, corroborado pela maior massa seca, 17,97%, em rela??o ao grupo controle, sendo selecionado para avalia??o nas vias de defesa da soja. A express?o do gene PAL foi moderadamente aumentada em plantas suscet?veis Stm45+Xag em 12 hpi, seguido por aumento da atividade da enzima PAL de 48 a 144 hpi, embora o ac?mulo correspondente de compostos fen?licos n?o tenha sido registrado. Na cultivar resistente, a express?o de PAL em plantas Stm45+Xag resultou em alta atividade desta enzima. A express?o aumentada de ERF5 e a diminui??o de express?o do gene JAZ em 12 hpi em plantas Stm45+Xag de ambas as cultivares sugeriram que etileno e ?cido jasm?nico desempenharam fun??o na defesa sist?mica induzida por Streptomyces sp. CLV45 contra Xag em plantas de soja.

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:29:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goulart_MarcelaCristina_M.pdf: 1843141 bytes, checksum: 317126844277b642b5edc69d405b000b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A soja é considerada uma das culturas mais importantes no Brasil, em função de seu alto valor sócio-econômico, determinado pelas inúmeras aplicações de seus produtos e subprodutos e consequente expressão no mercado interno e externo. No entanto, a cultura desta oleaginosa é frequentemente ameaçada com a ocorrência de um vasto número de doenças, que podem acarretar depreciação do produto, redução no rendimento e perdas econômicas para os produtores. Dentre as principais doenças bacterianas que afetam a cultura da soja, destacam-se a pústula bacteriana, causada por Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag); o crestamento bacteriano, causado por Pseudomonas savastanoi pv. glycines (Psg); e a murcha de Curtobacterium causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), ocasionando perdas na produção de até 40%. A condição sanitária das sementes é extremamente importante se considerarmos que elas são veículos desses agentes fitopatogênicos que nelas podem se alojar e serem levados ao campo, provocando redução na germinação e vigor, e originando focos primários de infecção de doenças. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver nova metodologia de diagnóstico com o uso das técnicas moleculares que permitissem detectar e identificar a presença de Psg, Xag e Cff em sementes de soja por meio do desenvolvimento de primers espécie específicos. Os primers desenhados a partir de sequências da região espaçadora 16S-23S RNAr, mostraram-se altamente específicos e sensíveis. O par de primers Curto2f/p322anti gerou um fragmento de 675 pb e capacidade de detecção a partir de 0,01 ng de DNA genômico e aproximadamente 5x103 UFC/PCR; o par de primers Psgl/p322anti gerou um fragmento de 500 pb e o grau mínimo de sensibilidade foi de 1 pg de DNA genômico e cerca de 80 UFC/PCR; o par de primers Xanth2f/p322anti gerou um fragmento de 545 pb e capacidade de detecção a partir de 1 ng de DNA genômico e cerca de 700 UFC/PCR. Posteriormente, as sementes de soja foram infectadas artificialmente nas condições de 1; 0,5 e 0,1% de infecção. Nas amplificações com os primers espécie-específicos desenvolvidos, foi possível detectar as fitobactérias em todos os níveis de infecção testados diretamente do extrato bruto, e nas amplificações após o enriquecimento do extrato (BIO-PCR) o sinal positivo foi potencializado / Abstract: Soybean is considered one of the most important crops in Brazil, due to its high socio-economic value, determined by its several products and sub products and its significant expression on the internal and external market. However, this oleaginous plant is often affected by the occurrence of different diseases, which cause depreciation of the product, reduction in yield and substantial economic losses. Among the main bacterial diseases, the bacterial pustule, caused by Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag), the bacterial blight caused by Pseudomonas savastanoi pv. glycines (Psg), and bacterial tan spot caused by Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), producing yield losses of up to 40%. The seed health is extremely important since they are considered vehicles of pathogenic agents which can be led to the field, causing germination reduction and vigor; and yielding primary infection of the diseases. This study aimed to develop a new method of diagnosis using molecular tools to detect and identify Psg, Xag or Cff in soybean seeds, through species-specific primers. The primers were designed from sequences of the 16S-23S rRNA and they were highly specific and sensitive. The pair of primers Curto2f/p322anti generated a fragment of 675 bp and was able of detecting down to 0.01 ng of genomic DNA and about 5x103 CFU/PCR; the primer set Psgl/p322anti produced a fragment of 500 bp and reached a detection limit of 1 pg of genomic DNA and about 80 CFU/PCR; and Xanth2f/p322anti yielded a fragment of 545 bp and could detect up to 1 ng of genomic DNA and about 700 CFU/PCR. Subsequently, soybean seeds were artificially infected in the following conditions: 1, 0,5% and 0,1% infection. In the amplifications using the species-specific primers, it was possible to detect the three different phytobacteria at all tested levels of infection directly of the crude extract and in the amplifications after enrichment of the extract (BIO-PCR), the positive signal was enhanced / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular