Faithful DNA replication is essential for the maintenance of genetic information. This complex process consists of 3 steps: initiation, elongation and termination. Although the first two steps are quite well understood in both eukaryotes and prokaryotes, many aspects of the termination of replication remain unclear. Escherichia coli is an ideal organism to study termination of DNA replication. In E. coli, DNA replication starts by bidirectional firing of two replication forks from a unique origin and terminates when those forks collide in the terminus region of the circular chromosome. The terminus region is flanked by specific ter sequences, which ensure that termination of replication occurs within specific boundaries. Due to the circularity of the E. coli chromosome, once the replication is finished the dimers can be formed. To resolve the dimers, the dif sequences are aligned together and two chromosomes are then separated into two daughter cells. Previous members of Prof. Leach laboratory have observed a stimulation of both double-strand break repair (DSBR) and DNA over-replication in the terminus region when DSBR was induced in the lacZ locus, half way between the origin and the terminus. In this work, I propose that these two phenomena, elevated levels of DSBR and DNA over-replication, are linked to each other. I confirm that the DSBs arise from the dif site and that the dif site is the source of DNA over-replication in the terminus. My results suggest that an attempted DSBR at dif leads to over-replication between terA and terB. Here, using next generation sequencing methods, I show that TopoIV and TopoIII topoisomerases introduce breaks in chromosome dimers that were not resolved by the XerCD/dif system, leading to DSBR and DNA over-replication.

Les dimères chromosomiques se produisant lors de la réparation de chromosomes circulaires peuvent être dommageables pour les bactéries en bloquant la ségrégation des chromosomes et le bon déroulement de la division cellulaire. Pour remédier à ce problème, les bactéries utilisent le système Xer de monomérisation des chromosomes. Celui-ci est composé de deux tyrosine recombinases, XerC et XerD, qui vont agir au niveau du site dif et procéder à une recombinaison qui aura pour effet de séparer les deux copies de l’ADN. Le site dif est une séquence d’ADN où deux répétitions inversées imparfaites séparées par six paires de bases permettent la liaison de chacune des recombinases. Cette recombinaison est régulée à l’aide de FtsK, une protéine essentielle de l’appareil de division. Ce système a été étudié en profondeur chez Escherichia coli et a aussi été caractérisée dans une multitude d’espèces variées, par exemple Bacillus subtilis. Mais dans certaines espèces du groupe des Streptococcus, des études ont été en mesure d’identifier une seule recombinase, XerS, agissant au niveau d’un site atypique nommée difSL. Peu de temps après, un second système utilisant une seule recombinase a été identifié chez un groupe des epsilon-protéobactéries. La recombinase fut nommée XerH et le site de recombinaison, plus similaire à difSL qu’au site dif classique, difH. Dans cette thèse, des résultats d’expériences in vitro sur les deux systèmes sont présentés, ainsi que certains résultats in vivo. Il est démontré que XerS est en mesure de se lier de façon coopérative à difSL et que cette liaison est asymétrique, puisque XerS est capable de se lier à la moitié gauche du site prise individuellement mais non à la moitié droite. Le clivage par XerS est aussi asymétrique, étant plus efficace au niveau du brin inférieur. Pour ce qui est de XerH, la liaison à difH est beaucoup moins coopérative et n’a pas la même asymétrie. Par contre, le clivage est asymétrique lui aussi. La comparaison de ces deux systèmes montrent qu’ils ne sont pas homologues et que les systèmes Xer à seule recombinase existent sous plusieurs versions. Ces résultats représentent la première découverte d’un espaceur de 11 paires de bases chez les tyrosine recombinases ainsi que la première étude in vitro sur XerH. / The chromosome dimers produced during the repair of circular chromosomes can be harmful to bacteria by blocking the segregation of the chromosome and cell division. To overcome this problem, bacteria use the Xer system for the monomerisation of chromosome dimers. It has two components, XerC and XerD, which act on the dif site and complete a recombination that will lead to the separation of the two copies of the DNA. The dif site is a DNA sequence where two imperfect inverted repeats separated by six base pairs allow the binding of each recombinase. This recombination is regulated by the protein FtsK, an essential member of the cell division machinery. The Xer system has been well studied in Escherichia coli and has also been characterized in a variety of species, for example Bacillus subtilis. Furthermore, in certain species of Streptococcus, studies have identified only a single recombinase, XerS, which acts on an atypical site named difSL in order to monomerize dimeric chromosomes. Not long after, a second system using a single recombinase was identified in a group of epsilon-proteobacteria. This recombinase was named XerH and the recombination site, difH, was found to more similar to difSL than to the classical dif sites. In this thesis, results from in vitro experiments on both systems are presented, as well as some results from in vivo experiments. We show that XerS is capable of binding cooperatively to difSL and that this binding is asymmetrical. This is because XerS is able to bind to the left half of the site but not to the right half when they are separated. The cleavage by XerS is also asymmetrical, as it is more efficient on the bottom strand. As for XerH, its binding to difH is much less cooperative and doesn’t have the same asymmetry. But the cleavage is also asymmetrical like the one seen in XerS. Comparing the two systems show that they are not homologuous and that more than one version of Xer systems using a single recombinase exists. These results represent the first discovery of an 11 bases pairs spacer for tyrosine recombinase. It is also the first in vitro studies of XerH.

Les dimères chromosomiques se produisant lors de la réparation de chromosomes circulaires peuvent être dommageables pour les bactéries en bloquant la ségrégation des chromosomes et le bon déroulement de la division cellulaire. Pour remédier à ce problème, les bactéries utilisent le système Xer de monomérisation des chromosomes. Celui-ci est composé de deux tyrosine recombinases, XerC et XerD, qui vont agir au niveau du site dif et procéder à une recombinaison qui aura pour effet de séparer les deux copies de l’ADN. Le site dif est une séquence d’ADN où deux répétitions inversées imparfaites séparées par six paires de bases permettent la liaison de chacune des recombinases. Cette recombinaison est régulée à l’aide de FtsK, une protéine essentielle de l’appareil de division. Ce système a été étudié en profondeur chez Escherichia coli et a aussi été caractérisée dans une multitude d’espèces variées, par exemple Bacillus subtilis. Mais dans certaines espèces du groupe des Streptococcus, des études ont été en mesure d’identifier une seule recombinase, XerS, agissant au niveau d’un site atypique nommée difSL. Peu de temps après, un second système utilisant une seule recombinase a été identifié chez un groupe des epsilon-protéobactéries. La recombinase fut nommée XerH et le site de recombinaison, plus similaire à difSL qu’au site dif classique, difH. Dans cette thèse, des résultats d’expériences in vitro sur les deux systèmes sont présentés, ainsi que certains résultats in vivo. Il est démontré que XerS est en mesure de se lier de façon coopérative à difSL et que cette liaison est asymétrique, puisque XerS est capable de se lier à la moitié gauche du site prise individuellement mais non à la moitié droite. Le clivage par XerS est aussi asymétrique, étant plus efficace au niveau du brin inférieur. Pour ce qui est de XerH, la liaison à difH est beaucoup moins coopérative et n’a pas la même asymétrie. Par contre, le clivage est asymétrique lui aussi. La comparaison de ces deux systèmes montrent qu’ils ne sont pas homologues et que les systèmes Xer à seule recombinase existent sous plusieurs versions. Ces résultats représentent la première découverte d’un espaceur de 11 paires de bases chez les tyrosine recombinases ainsi que la première étude in vitro sur XerH. / The chromosome dimers produced during the repair of circular chromosomes can be harmful to bacteria by blocking the segregation of the chromosome and cell division. To overcome this problem, bacteria use the Xer system for the monomerisation of chromosome dimers. It has two components, XerC and XerD, which act on the dif site and complete a recombination that will lead to the separation of the two copies of the DNA. The dif site is a DNA sequence where two imperfect inverted repeats separated by six base pairs allow the binding of each recombinase. This recombination is regulated by the protein FtsK, an essential member of the cell division machinery. The Xer system has been well studied in Escherichia coli and has also been characterized in a variety of species, for example Bacillus subtilis. Furthermore, in certain species of Streptococcus, studies have identified only a single recombinase, XerS, which acts on an atypical site named difSL in order to monomerize dimeric chromosomes. Not long after, a second system using a single recombinase was identified in a group of epsilon-proteobacteria. This recombinase was named XerH and the recombination site, difH, was found to more similar to difSL than to the classical dif sites. In this thesis, results from in vitro experiments on both systems are presented, as well as some results from in vivo experiments. We show that XerS is capable of binding cooperatively to difSL and that this binding is asymmetrical. This is because XerS is able to bind to the left half of the site but not to the right half when they are separated. The cleavage by XerS is also asymmetrical, as it is more efficient on the bottom strand. As for XerH, its binding to difH is much less cooperative and doesn’t have the same asymmetry. But the cleavage is also asymmetrical like the one seen in XerS. Comparing the two systems show that they are not homologuous and that more than one version of Xer systems using a single recombinase exists. These results represent the first discovery of an 11 bases pairs spacer for tyrosine recombinase. It is also the first in vitro studies of XerH.