Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1192795 bytes, checksum: 39105ae81e1f922a4d76be541c837833 (MD5) Previous issue date: 2006-09-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Sw-5 protein codified by the tomato Sw-5 gene confers broad spectrum tospovirus resistance. This protein contains a coil-coiled aminoterminal domain, a central nucleotide binding site domain and a leucine-rich repeat carboxi-terminal domain. These domains suggest that Sw-5 recognizes directly or indirectly virus elicitors and it participates in a signal transduction pathway that leads to the death of infected cells and activation of plant defense responses. The objective of this work was to identifiy and characterize genes encoding proteins that interacts physically with Sw-5 in the yeast two hybrid system. The screening of 5x107 Nicotiana benthamina cDNA clones, using the yeast mating strategy, did not yield any protein capable to interact with Sw-5. Analyzing 1,8 x 105 clones by co-transformation strategy, it was possible identify a cDNA that encodes an chloroplast ferredoxin I (Nb-Fd1) capable to interact with Sw-5. This protein contains a domain and a signature of 2Fe-2S proteins. Virus-induced silencing of the Nb-Fd1 gene leads to a grater number of local necrotic lesions and apical lesions in resistance plants challenged with tospovirus showing that this gene is important for tomato tospovirus resistance. This phenotype indicates that Nb-Fd1 is possibly involved in cellular redox state alteration, reactive oxygen species accumulation and programmed cell death activation processes mediated by Sw-5. / A proteína Sw-5 codificada pelo gene Sw-5 de tomateiro confere resistência de amplo espectro a tospovírus. Essa proteína contém um domínio amino-terminal coil-coiled, um domíno central de ligação a nucleotídeos fosfatados e uma região carboxi-terminal com repetições ricas em leucina. Esses domínios sugerem que a proteína Sw-5 reconhece direta ou indiretamente elicitores produzidos pelo vírus e participa de uma cadeia de transdução de sinais que leva à morte das células inicialmente infectadas pelos tospovírus e, ou, ativação de respostas de defesa da planta. Este trabalho teve como objetivo a identificação e a caracterização molecular de genes que codificam proteínas capazes de interagir fisicamente com a proteína codificada pelo gene de resistência Sw-5 por meio da utilização do sistema duplo-híbrido de leveduras. A triagem 5x107 clones de cDNAs de Nicotiana benthamina por meio da obtenção de diplóides, não revelou nenhum cDNA que codifica proteína capaz de interagir com a proteína Sw-5. A análise de 1,8 x 105 clones pelo processo de co-transformação resultou na identificação de um cDNA que codifica uma proteína ferredoxina I de cloroplasto (Nb-Fd1), capaz de interagir com a proteína Sw-5. Essa proteína contém um domínio e uma assinatura característicos de proteínas 2Fe-2S. Resultados preliminares mostraram que o silenciamento do gene que codifica Nb-Fd1 resulta em uma maior quantidade de lesões necróticas locais e lesões no ápice das plantas resistentes desafiadas com tospovírus evidenciando a não contenção do vírus no sítio de infecção. Esse fenótipo demonstra um papel de Nb-Fd1 na resistência a tospovírus. Assim, é possível que esta proteína participe do processo de alteração do potencial redox da célula, acúmulo de espécies reativas de oxigênio e ativação de morte celular programada que caracterizam a resposta de hipersensibilidade mediada pelo gene Sw-5.

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T08:03:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Passos_DarioOliveirados_D.pdf: 4831709 bytes, checksum: 0aa3e031d4e82dc447636416b68401e8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A proteína Ki-1/57 que é encontrada tanto no núcleo quanto no citoplasma está associada com atividade de proteína quinase serina/treonina e é fosforilada nestes resíduos após ativação celular. Neste trabalho verificamos que Ki-1/57 interage com a proteína Chromatin-Helicase-DNA-binding domain 3 (CHD3) e com a proteína adaptadora/sinalizadora RACK1 no núcleo. Pelo sistema do duplo híbrido de levedura (SDHL) a proteína arginina metiltransferase 1 (PRMT1) foi selecionada como outra proteína de interação. A PRMT1 integra uma família representada por nove enzimas humanas que catalisam reações de metilação em resíduos de arginina. Em seguida, usando agora a PRMT1 como isca - no SDHL - identificamos as proteínas Ki-1/57 e hnRNPQ, juntamente com outras 13. A maioria delas contêm motivos ¿RGG-box¿ em suas seqüências de aminoácidos, que são conhecidos alvos para metilação. Posteriormente verificamos que Ki-1/57 e seu provável parálogo CGI-55 conservam dois motivos ¿RGG/RXR-box¿ e que são substratos in vitro para a metilação de argininas pela PRMT1. Estudos de mapeamento mostraram que todos os fragmentos contendo o motivo ¿RGG/RXR-box¿ interagem com a PRMT1 e são alvos à metilação in vitro. Ki-1/57 endógena, imunoprecipitada de células L540, mostrou ser metilada in vivo, além de ser um alvo a metilação pela PRMT1 in vitro, somente quando as células são previamente tratadas com o inibidor da metilação Adox. Tratamento das células Hela com o inibidor da metilação (Adox) causa desaparecimento da imuno-marcação citoplasmática de Ki-1/57 e relativa redistribuição do parálogo CGI-55 para o citosol. Assim, pode ser especulado que a metilação destas proteínas deve ser um evento importante para suas localizações subcelulares e conseqüentemente para suas funções. Em resumo, nossos dados sugerem que o SDHL é um método efetivo na identificação de novos substratos celulares para a PRMT1 e poderia ser estendido para a identificação e caracterização de novos substratos para os outros integrantes da família das PRMTs humanas / Abstract: The protein Ki-1/57 that is found both in the cytoplasm and nucleus is associated with serine/threonine protein kinase activity and gets phosphorylated on serine and threonine residues upon cellular activation. We demonstrated that Ki-1/57 interacts with the Chromatin-Helicase-DNA-binding domain protein 3 (CHD3) and with the adaptor/signaling protein RACK1 in the nucleus. By utilizing the yeast two-hybrid system (YTHS), we were further able to find the protein arginine-methylatranseferase-1 (PRMT1) as another interacting protein. PRMT1 is a member of the family constituted by 9 human enzymes that catalyze methylation reactions on arginine residues. Afterwards, by using PRMT1 as bait in the YTHS we identified both Ki-1/57 and NSAP1 as interacting proteins, along with 13 other proteins. The majority of them present RGG-box clusters in their amino acid sequences, which are known to be targets for arginine methylation. We further found that Ki-1/57 and its putative paralogue CGI-55 have two RGG/RXR-box clusters conserved between them and that they are substrates for arginine-methylation by PRMT1 in vitro. In mapping studies, we observed that all Ki-1/57 protein fragments containing the RGG/RXRbox clusters interact with PRMT1 and are targets for methylation in vitro. Endogenous cellular Ki-1/57 seems to be methylated in vivo and is a target for methylation by PRMT1 in vitro, only when cells have been previously treated with the methylation inhibitor Adox. Treatment of Hela cells with the inhibitor of methylation (Adox) causes the disappearance of the immuno-staining of Ki-1/57 in the cytoplasm and a relative redistribution of the paralogue CGI-55 to the cytosol. It can therefore be speculated that the methylation of these proteins is important for their sub-cellular localization and in consequence for their function. In summary our data suggest that the YTHS is an effective method for the identification of novel cellular PRMT substrates and could be extended for the identification and characterization of novel substrates to the other components of the human PRMT1 family / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular