Zellmigration ist essentiell für die Invasion und Metastasierung maligner Tumore. Neben der Bewegung von Einzelzellen zeigen Tumore sowohl epithe¬lialen als auch mesenchymalen Ursprungs auch kollektive Migration und Invasion multizellulärer Zellverbände, die sich unter Beibehaltung von Zell-Zell-Adhäsionen koordiniert als Gruppe bewegen. Ziel der Arbeit war, primäre humane Melanomexplantate mittels organotypischer Kultur in 3D Kollagenmatrices einzusetzen, um mittels Zeit-raffermikroskopie und experimentellen Blockadestrategien die zellulären und molekularen Grundlagen kollektiver Migration darzustellen, insbesondere die Bedeutung von Zell-Matrix-Interaktionen und Integrinen. In 3D Explantatkulturen bildeten primäre Melanomexplantate reproduzierbar Invasionszonen und sich ablösende und kollektiv wandernde Zellcluster aus. Diese zeichneten sich durch eine ausgeprägte Polarität mit motiler Vorderfront mit zugartig reorientierten Kollagenfasern und nachgezogenem hinteren Teil der Gruppen aus, vergleichbar der Asymmetrie haptokinetisch migrierender Fibroblasten. β1 Integrine zeigten ein heterogenes Verteilungsmuster mit Fokalisierung an Zell-Matrix-Interaktionen vor allem an der Vorderfront und linearer Anordnung entlang der Zell-Zell-Grenzen. Adhäsionsblockierende anti- β1 Integrin-Antikörper bewirkten nahezu vollständige Hemmung der kollektiven Migration, mit Verlust der Zellgruppenpolarität und Migrationspersistenz. Nach Integrinblockade zerfielen Zellverbände infolge Loslösung von Einzelzellen, die sich mittels β1 Integrin-unabhängiger, amöboider Migration durch die Kollagenmatrix bewegten. Der Übergang von β1 Integrin-abhängiger, kollektiver Migration zu amöboider Einzelzellwanderung (kollektiv-amöboide Transition) ist ein Beispiel für die Plastizität von Tumorzellwanderung, die in Anpassung an das Milieu einen Wechsel der Migrationsstrategie erlaubt. Die Plastizität der Tumorzellmigration muss bei der Entwicklung therapeutischer Konzepte, die auf Hemmung von Tumorinvasion und -metastasierung abzielen, berücksichtigt werden. / Cell migration is essential for invasion and metastasis of malignant tumors. Besides migration of single cells tumors of epithelial as well as mesenchymal origin show collective migration and invasion of multicellular Clusters, which move coordinated as a group while maintaining cell-cell-adhesions. The purpose of this study was to cultivate primary human melanoma explants in an organotypic 3D collagen matrix and examine the cellular and molecular basis of collective cell migration by time-lapse videomicroscopy and blocking experiments with a special emphasis on integrins and cell-matrix-interactions. In 3D culture primary melanoma explants reproducibly formed invasion zones and detaching cell clusters then migrating collectively as a group. These Clusters exhibited a strong polarity with a mobile front and tension-reoriented collagen fibers and a passively gliding rear end, comparable to the asymmetry found in the haptokinetic migration of fibroblasts. β1 integrins were distributed heterogeneously with focalization predominantly in cell-matrix-interactions at the front and linearly in cell-cell-interactions. Adhesion-blocking anti-β1 integrin-antibodies lead to a near complete inhibition of collective migration with a loss of polarity of the group and loss of persistence of migration. After Integrin blockade clusters disrupted due to detaching single cells that continued to migrate independently of β1 integrins through the collagen matrix using an ameboid migration strategy. The switch of β1 integrin-dependent collective migration to single cell ameboid migration (collective-to-ameboid transition) is an example for the plasticity of tumor cell migration while adapting to the milieu that allows a change in migration strategy. Plasticity of tumor cell migration needs to be considered in the development of therapeutic concepts targeting tumor invasion and metastasis.

Ulm, Univ. Diss., 2005.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Universität Regensburg, Univ., Diss., 2005. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2004

Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2005

Ulm, Univ., Diss., 2007.

Techn. Universiẗat, Diss., 2004--Darmstadt.

Die Migration von Tumorzellen im Bindegewebe erfordert adhäsive Zell-Matrix-Interaktionen, die durch Integrine und andere Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche vermittelt werden. In 3DKollagenmatrices benötigen hochinvasive MV3-Melanomzellen überwiegend &#945;2&#946;1-Integrine zur Elongation, Adhäsion an den Kollagenfasern und zur Faserbündelung, sowie zur Kraftgenerierung und Migration. Wir haben untersucht, ob die Migration von Tumorzellen in 3D-Kollagenmatrices vollständig durch die Blockade der Integrinfunktion inhibierbar ist, oder ob es kompensatorische Mechanismen gibt, die zur Migration beitragen. Die &#946;1-Integrinfunktion wurde durch verschiedene Methoden reduziert: a) durchflusszytometrische Sortierung der Zellen in Subgruppen mit niedriger und hoher &#946;1-Integrin-Oberflächenexpression; b) Adhäsionsblockade mit monoklonalem anti &#946;1-Antikörper 4B4 oder Rhodocetin, einem selektiven &#945;2&#946;1-Integrininantagonist; und c) Expression von dominant-negativen Peptiden zur Blockade der Funktion der &#946;1-Integrin-zytoplasmatischen Domäne. Alle &#946;1-Integrin-Interferenzstrategien induzierten einen Übergang der konstitutiv vorhandenen mesenchymalen Migration in einen neuen, amöboiden Migrationstyp (Mesenchymal-Amoeboid Transition, MAT), ähnlich der Migrationsweise von Monozyten oder Lymphozyten. Der Übergang zu amöboider Migration ging einher mit dem Verlust der zellvermittelten Kollagenkontraktion und -reorganisation. Subtotale Inhibition der Integrinfunktion (ca. 50%) durch Antikörper 4B4 ergab eine schnelle (0,3-0,4 >m/min) amöboide Migration, während 90-95%ige Absättigung des &#946;1-Integrin- Epitops zu langsamer amöboider Migration (0,03-0,2 >m/min) führte. Induzierte amöboide Migration verursachte eine gleichmäßige Verteilung der &#946;1-Integrine auf der Zelloberfläche, ein diffuses kortikales Aktin-Zytoskelett, und war mit einer ausgeprägten Formanpassung der Zelle an die Matrixstrukturen verbunden, die von kleinen Filopodien oder Oberflächenblebs getragen wurde. Die Befunde wurden für &#946;1-Integrin-defiziente murine embryonale Fibroblasten (MEF) und murine embryonale Stammzellen (GD25) bestätigt. &#946;1-Integrin-defiziente Fibroblasten zeigten eine schnelle, und GD25 ES-Zellen eine langsame amöboide Migration. Somit erfolgte die amöboide Migration ohne &#946;1-Integrin-vermittelte Zell-Matrix-Interaktionen. Weil keine vollständige Immobilisierung der Zellen erzielt wurde, haben wir alternative Mechanismen von Zell-Matrix-Interaktionen untersucht, die zur Restaktivität der amöboiden Migration beitragen. Als potentielle Kandidaten wurden &#945;v-Integrine, die an denaturiertes Kollagen binden, und Oberflächen-Glycokonjugate getestet. Es wurden keine promigratorischen Funktionen RGDabhängiger Integrine (&#945;v oder &#946;3) mittels zyklischer Arginin-Glycin-Asparaginsäure (cRGD)beobachtet. Um herauszufinden, welche Rolle die Oberfächen-Glycokalyx bei der Zellmigration spielen, wurden verschiedene Methoden angewandt: a) Die an die Proteine gebundenen Glycokonjugate wurden mit Hilfe von N- und O-Glycosidasen von der Oberfläche der lebenden Zellen enzymatisch abgespalten; b) um die Sulfatierung der Glycokonjugate zu verhindern, wurden die Zellen in sulfatfreiem Medium kultiviert. Durch beide Methoden wurde die Bindung von Rutheniumrot an die Zelloberfläche(Glycokalyx) um 60% bzw. die von Heparansulfat der Zelloberfläche um 60% bis 100% reduziert. Nicht die Desulfatierung führte zur Ablösung der Zellen vom Kulturflaschenboden, sondern allein dieBehandlung mit N- und O-Glycosidasen. Die gleichzeitige Behandlung von MV3 Melanomzellen mit N-, O- Glycosidase mit Inhibition der &#946;1-, &#945;v&#946;3-Integrine führten zur Abrundung der Mehrzahl der Zellen, gefolgt von oszillierender Immobilität (‚Running on the spot’) bzw. sehr langsamer Restmigration (<0,1 >m/min). Dagegen war die Migration der MV3-Zellen nach Kultivierung in sulfatfreiem Medium unverändert. Eine ähnliche Hemmung der Migration erfolgte in &#946;1-/- MEFs nach Glycanverdau. Folglich sind &#946;1-Integrine essentiell für fokalisierte Zell-Matrix-Interaktionen, für die mesenchymale Migration und den Matrixumbau, während amöboide Migration ohne Beteiligung von &#946;1-Integrinen erfolgt, aber durch niedrigaffine, diffuse Zell-Matrix-Interaktionen von Oberflächenglycanen vermittelt wird. Somit ist die Glycokalyx ein alternatives Adhäsionssystem für die integrinunabhängige Zellmigration. / Cancer cell migration through connective tissue requires adhesive cell matrix interactions mediated by surface integrins and other adhesion molecules. We investigated whether invasive migration in 3D ECM environments is fully abrogated by blocking integrin functions and whether compensation mechanisms might support migratory rescue. Within 3D collagen matrices, highly invasive MV3 melanoma cells preferentially utilize &#945;2&#946;1 integrins for elongation, adhesion to collagen fibers, fiber bundling, force generation, and migration. &#946;1 integrin function was reduced by a) flow cytometric sorting for subsets expressing low integrin levels; b) blocking anti &#946;1 mAb 4B4 at different concentrations or using rhodocetin, a selective &#945;2&#946;1 integrin inhibitor; and c) expression of dominantnegative peptides to compete with the &#946;1 integrin cytoplasmatic domain function. For migration in 3D collagen lattices, all &#946;1 integrin-lowering strategies uniformly resulted in conversion from constitutive mesenchymal migration to a novel amoeboid type of migration resembling monocytes or lymphocytes. The conversion to amoeboid movement was accompanied by abrogation of cell-mediated collagen contraction and reorganisation. Inhibition of integrin function by blocking antibody by approximately 50% led to fast (0.3-0.4 >m/min) but near-100% amoeboid migration, whereas 90 to 95% epitope saturation let to slow (0.03-0.2 >m/min) amoeboid migration. Induced amoeboid migration was accompanied by cell shape changes supported by small filopodia and/or surface blebs, uniform distribution of surface integrins and the lack of focalization of the cytoskeleton. Results were corroborated in &#946;1-deficient murine embryonic fibroblasts (MEFs)and murine embryonic stem cells (GD25). &#946;1-/- MEFs displayed a fast, and GD25 ES cells a slow amoeboid migration. Thus, migration could be sustained without &#946;1 integrin-mediated cell-matrix interactions. Because no complete immobilization was achieved, alternative cell-matrix interaction mechanisms underlying residual amoeboid migration were investigated. As candidates, &#945;v integrins binding denatured collagen and the surface glycoconjugates were tested, yet no promigratory role of RGD dependent integrins (&#945;v or &#946;3) was found using cyclic tripeptide arginine-glycine-aspartic acid (cRGD). To investigate the role of surface glycoconjugates, we a) enzymatically removed protein-bound glycoconjugates of the living cells using N-and O-glycosidases and b) prevented sulphation of glycoconjugates by culturing cells in sulphate-free medium. Both methods reduced surface Ruthenium red binding by 60% and heparan sulphate surface levels by 60 and 100% respectively, however only N- and O-glycosidase treatment but not desulphation caused cell detachment from the culture flask. Simultaneous treatment of MV3 melanoma cells with N- and O-glycosidase and inhibition of &#946;1, &#945;v&#946;3 integrins resulted in complete loss of polarity, cell rounding of most cells and oscillating immobility (“running on the spot”), or extremely slow residual migration below 0.1 >m/min. Sulphate-depleted medium alone did not yield any migration reduction in MV3 cells. Similar inhibition after N- und O-glycosidase treatment was obtained in &#946;1-/- MEFs. In conclusion, &#946;1 integrins are sufficient to maintain focalized cell-matrix interactions, mesenchymal migration, and matrix remodelling the abrogation of with supports transition to amoeboid migration mediated by low affinity interactions via surface glycans but not sulphated residues. Thus, the surface glycocalyx provides an alternative adhesion system sustaining integrin-independent amoeboid migration, which may approximate the minimal requirements of cell migration in an interstitial 3D tissue.

Auf dem Weg vom Primärtumor zur systemischen Metastasierung, der Haupttodesursache von Krebserkrankungen, ist die Einzelzellmigration von Tumorzellen durch dreidimensionales Bindegewebe ein entscheidender Schritt. Die vorliegende Arbeit zeigt Untersuchungen zur Tumorzellmigration und –plastizität in einem 3D-Migrationsmodell. Kleine G-Proteine kontrollieren Zytoskelettfunktionen, insbesondere Aktinpolymerisation und die Bildung von Zellprotrusionen durch Rac sowie Actomyosinkontraktion durch Rho. Durch pharmakologische Inhibitoren von Rac und dem Rho-Effektor ROCK soll deren Bedeutung für Einzelzellmigration in einem dreidimensionalen Modell und vor allem der Effekt auf Morphologie, Plastizität und Migration von Tumorzellen geklärt werden. Nach Inhibition von ROCK zeigen hochinvasive HT1080 Fibrosarkomzellen einen multipolar-dendritischen und sessilen Phänotyp. Nach Hemmung von Rac wird hingegen ein rundlicher, aber ebenfalls apolarer und sessiler Phänotyp induziert. Bei simultaner Inhibition von Rac und ROCK entstehen rundliche, apolare, sessile Zellen mit abortiven Pseudopodien. Wird das Gleichgewicht von Rac und ROCK durch konstitutive Aktivierung von ROCK gestört, so entsteht eine zweigeteilte Population, bestehend aus rundlichen Zellen, die Blebs bilden, und langgezogenen Zellen. Nach Sortierung nach ihrem ß1-Integrinexpressionsniveau zeigten Zellen mit niedriger Integrin-Expression einen rundlichen Migrationstyp mit blasenartigen dynamischen Protrusionen, während Zellen mit hoher Integrin-Expression langgezogen-mesenchymal migrierten. Somit steuern ROCK und Rac gemeinsam und zeitgleich die mesenchymale Einzelzellmigration. Während Rac Protrusion vermittelt, ist ROCK für Kontraktilität und Retraktion verantwortlich. Erst durch Koordination von Rac und Rho/ROCK entsteht somit Polarität und 3D mesenchymale Migration. / In the development from a primary tumor to metastatic dissemintation, which is the main cause of death from cancer, single cell migration through three-dimensional tumor stroma is an essential step. This work presents data concerning tumor cell migration and plasticity in a three-dimensional migration model. Small G-proteins control cytosceletal functions, especially actin polymerisation and the formation of cell protrusions through Rac as well as actomyosin contractility through Rho. Using pharmacological inhibitors of Rac and the Rho effector ROCK their impact on single-cell-migration in a three-dimensional model and particularly on morphology and plasticity of migration of tumor cells should be clarified. After inhibition of ROCK highly invasive HT1080 fibrosarcoma cells show a multipolar-dendritic and sessile phenotype. Inhibtion of Rac however induced a rounded phenotype which was also apolar and sessile. Simultaneous inhibition of ROCK and Rac resulted in rounded, apolar, sessile cells with abortive pseudopods. After disturbing the balance of ROCK and Rac by constitutive activation of ROCK, a divided population of cells developed, consisting of rounded, blebby cells and elongated cells. After sorting the cells according to their level of ß1-integrin expression, cells with low expression of integrins adopted a rounded type of migration with blebby dynamic protrusions, whereas cells with high integrin expression migrated in a elongated-mesenchymal way. Thus ROCK and Rac control together and simultaneously mesenchymal single cell migration. While Rac mediates protrusion, ROCK is responsible for contractility and retraction. Consequently only by coordination of Rho/ROCK and Rac polarity and mesenchymal 3D migration becomes possible.